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    傳統(tǒng)調(diào)味品中納豆激酶產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

    2018-11-15 03:11:02王俊芳劉佳佳劉佳音
    中國調(diào)味品 2018年11期
    關(guān)鍵詞:納豆尿激酶激酶

    王俊芳,劉佳佳,劉佳音

    (1.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河南 開封 475004;2.河南大學(xué) 健康與護(hù)理學(xué)院,河南 開封 475004)

    納豆是將黃豆蒸煮過后,在納豆枯草芽孢桿菌的發(fā)酵作用下制成的,是一種具有粘性、口感潤滑、營養(yǎng)成分極豐富的豆制品,其營養(yǎng)價值較大豆倍增[1,2]。研究表明,納豆發(fā)酵過程中納豆菌產(chǎn)生了一種能夠直接溶解纖維蛋白的堿性絲氨酸蛋白酶活性物質(zhì),即納豆激酶(nattokinase)。納豆激酶是日本科學(xué)家須見洋行從納豆中首先發(fā)現(xiàn)并命名的,因其顯著的溶血栓作用而備受矚目[3]。納豆激酶的溶血栓能力明顯強于尿激酶、鏈激酶、t-PA、蛇毒制劑、DSPA等具有一定副作用的溶血栓藥物。納豆激酶作用迅速,使用安全,無毒副作用,半衰期長,具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。隨著血栓類疾病對人類健康的危害日益加重,人們開始注重養(yǎng)生,食用納豆激酶保健品的人們越來越多。而納豆作為調(diào)味品,具有預(yù)防心腦血管疾病、抗氧化、降血壓、抗癌、防治骨質(zhì)疏松、美容等保健功能[4-6]。由于購買的商品納豆大多都有胺臭味,聞起來有點讓人難以接受。因此,本文旨在對納豆激酶產(chǎn)生菌進(jìn)行篩選、鑒定,以獲得符合國人口味的醬香型發(fā)酵納豆生產(chǎn)用菌種。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品

    自制豆豉、豆醬等發(fā)酵豆制品。

    1.1.2 主要試劑

    凝血酶(1000 U)、纖維蛋白原、尿激酶(≥7200 U):均購自北京索萊寶科技有限公司;其他試劑:均為市售分析純。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    斜面培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基[7]:蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂20 g/L,用來活化及保藏菌種。

    初篩選培養(yǎng)基(牛奶平板):用來篩選產(chǎn)蛋白酶的菌株,配制方法是向配好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量濃度為15 g/L的牛奶,溫度105 ℃,時間30 min,單獨滅菌。

    液體發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂20 g/L,用于菌種的發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品的處理

    將不同的豆豉、豆醬等樣品各取5 g,分別加入裝有20 mL無菌水和10顆玻璃珠的錐形瓶中,在溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min下振蕩20 min,再于室溫下浸提1 h,轉(zhuǎn)速3000 r/min離心5 min,即制得菌懸液。

    1.2.2 納豆激酶生產(chǎn)菌株的篩選

    1.2.2.1 初篩

    將制得的菌懸液于80 ℃水浴鍋中熱處理20 min,再將不同樣品制得的菌懸液用生理鹽水倍比稀釋,取10-1,10-2,10-3,10-44個濃度梯度,分別取100 μL涂布牛奶平板,在30 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h。

    1.2.2.2 復(fù)篩

    觀察牛奶平板上長出的單菌落,選出透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株,用無菌牙簽接種到牛奶平板上。放入30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,再次選出透明圈比值較大的菌株。將篩選出的菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化,重復(fù)篩選3次。

    挑取純化的單菌落,接種到LB斜面培養(yǎng)基,30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 納豆激酶酶活分析

    1.2.3.1 制備納豆激酶粗酶液

    將篩選得到的高產(chǎn)菌株用無菌牙簽挑取,分別接種到30 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,在全溫度振蕩培養(yǎng)箱中在30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)22 h。取出后在4 ℃,轉(zhuǎn)速12000 r/min下離心10 min,取其上清液,即得到納豆激酶粗酶液。

    1.2.3.2 配制改良的纖維蛋白原平板

    參考Astrup等的方法[8]:利用瓊脂糖、凝血酶和纖維蛋白原按比例混合制成人工血栓平板:配制瓊脂糖溶液:將0.1 g的瓊脂糖加入到10 mL蒸餾水中,用微波爐加熱使之溶解,在121 ℃滅菌20 min,使用前在45 ℃下恒溫水浴10 min;配制纖維蛋白原溶液:將0.01 g纖維蛋白原加入到10 mL 10 mol/L的PBS緩沖液中(pH為7.44),振蕩搖勻后在45 ℃下恒溫水浴10 min備用;將凝血酶稀釋至100 U/mL,取10 μL加入到配制好的瓊脂糖溶液中,快速搖晃均勻,倒入9 cm的無菌平板中,在室溫下放置一段時間使其充分冷卻凝固。

    1.2.3.3 制作尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

    參考張杰等描述的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法[9]。首先將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至50,200,400,600,800,1000 U/mL,分別取10 μL上樣于配制好的均勻擺放了牛津杯的纖維蛋白平板上,在室溫下靜置10 min,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,取出后用游標(biāo)卡尺測量各個溶解圈的直徑,計算出各個溶圈的面積。將尿激酶的酶活力單位數(shù)作為橫坐標(biāo),將溶解圈的面積作為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.3.4 納豆樣品酶活檢測

    加樣:將滅過菌的牛津杯均勻放置在纖維蛋白平板上,加入10 μL納豆激酶粗酶液,在室溫下靜置10 min后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

    觀察溶解圈的大小,測量其直徑,計算溶解圈面積。對照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的酶活。

    1.2.4 納豆激酶產(chǎn)生菌生長曲線的測定

    將篩選出的納豆激酶產(chǎn)生菌接種到牛肉膏液體培養(yǎng)基中,放入37 ℃,200 r/min的搖床中培養(yǎng),每隔2 h測量其OD595值,重復(fù)測量3次。將OD595值作為縱坐標(biāo),生長時間作為橫坐標(biāo),做出納豆激酶產(chǎn)生菌的生長曲線。

    1.2.5 納豆制備及其感官評價

    從本實驗篩選出的納豆菌株中,挑選出纖溶活性較好的菌株,另外,再以枯草芽孢桿菌1-44菌株作為對照,分別制備待發(fā)酵菌株的種子液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    挑選大小相對一致、無蟲咬和顆粒飽滿的大豆。將大豆清洗干凈,以3∶1的比例加入水,在室溫下浸泡18 h,將水過濾掉,分裝到250 mL的錐形瓶中,40 g/瓶,放入高壓蒸汽滅菌鍋,121 ℃下蒸煮30 min。取出后冷卻至50 ℃左右,加入2 mL菌懸液,充分混勻,在37 ℃下恒溫發(fā)酵24 h,發(fā)酵完成后放入4 ℃冰箱中,后熟24 h后即得到納豆制品。

    將制得的納豆轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中,攪拌均勻后測定其拉絲長度。具體方法是用玻璃棒挑起,以20 cm作為1個單位,拉出20 cm后再從中間挑起20 cm,重復(fù)至拉斷為止。另外,對納豆的氣味、口感、色澤、拉絲和納豆激酶酶活等指標(biāo)分別進(jìn)行感官評價。評價方式參考馬明等的方法進(jìn)行[10]。品評人數(shù)為10人,分別對納豆單項指標(biāo)進(jìn)行打分,并綜合評價。

    1.2.6 納豆激酶產(chǎn)生菌的鑒定

    1.2.6.1 形態(tài)觀察和生理生化鑒定

    參照東秀珠《常見細(xì)菌鑒定手冊》,對篩選得到的納豆激酶生產(chǎn)菌進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化鑒定實驗[11]。

    1.2.6.2 PCR檢測

    PCR產(chǎn)物由上海生工擴增及測序。提取目標(biāo)菌株基因組,并以其為模板,采用細(xì)菌16Sr DNA通用引物F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴增,PCR擴增體系為:ddH2O 15.9 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL,Mg2+(1.5 mmol/L)1.5 μL,dNTP (10 mmol/L)2.0 μL,P1 (10 mmol/L)1.0 μL,P2 (10 mmol/L) 1.0 μL,模板1.0 μL,rTaq酶0.1 μL,PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

    1.2.6.3 16S rDNA 測序及同源性分析

    測序結(jié)果在RDP 網(wǎng)站(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)數(shù)據(jù)庫檢出與所測菌16S rDNA 序列同源性較高的序列,判斷16S rDNA 基因鑒定結(jié)果。

    1.2.6.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

    在RDP 核苷酸數(shù)據(jù)庫中挑選出同源性較為相近的16S rDNA 序列,用MEGA 7.0軟件鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行1000次步長計算,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.7 不同培養(yǎng)條件下對納豆激酶產(chǎn)生菌的酶活測定

    分別在不同的初始pH值和發(fā)酵溫度下,針對篩選出的纖維活性最高的菌株,進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的實驗,觀察這些培養(yǎng)條件對產(chǎn)納豆激酶的影響,實驗設(shè)計如下:

    (1)將250 mL的瓶分裝30 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,初始pH分別調(diào)為5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,接種高產(chǎn)菌后于37 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min下?lián)u床發(fā)酵24 h,測其OD595值及相對酶活。

    (2)將高產(chǎn)菌接種到pH和鹽離子都一定的液體培養(yǎng)基中,分別放在25,28,35,37,40 ℃幾個不同溫度下發(fā)酵,24 h后分別測量其相對酶活,觀察溫度對產(chǎn)酶的影響。

    (3)在配制液體培養(yǎng)基時,將牛肉膏培養(yǎng)基中原本單一的Na+換成用Mg2+,K+,Ca2+,Mn2+分別與Na+按一定比例組合加入,鹽離子加入量為0.2 g/L,pH都調(diào)為7,分裝成30 mL/瓶,接種高產(chǎn)菌,培養(yǎng)條件及酶活測定方法同(1),比較各離子對產(chǎn)酶的影響。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    實驗重復(fù)3次及以上,數(shù)據(jù)采用平均值,數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析,計量數(shù)據(jù)組間比較利用Duncan檢驗分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 納豆激酶生產(chǎn)菌株的篩選

    利用牛奶平板對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行初篩選,共選出15株纖溶性明顯的菌株。測量這些菌株的透明圈直徑和菌落直徑,并計算其比值。通過計算從中挑選出4株直徑比較大的菌株,結(jié)果見圖1。各菌株周圍均有明顯的透明圈,N-2菌株的直徑比最大,高于枯草芽孢桿菌1-44和1-37菌株的直徑比。

    圖1 牛奶平板初篩納豆激酶產(chǎn)生菌Fig.1 Screening nattokinase producing strains in milk plate

    2.2 納豆激酶酶活分析

    通過測量尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活,制得的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,得到線性回歸方程:y=0.320x+54.13,R2=0.994,表明線性關(guān)系良好。

    圖2 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Urokinase standard curve

    將測得的溶解圈面積對照尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算可得。本實驗從豆制品分離篩選出的幾株纖溶性好的菌種中,N-2菌株的酶活力最高,達(dá)到了1159 U/mL,結(jié)果見表1。

    表1 不同菌株納豆激酶酶活Table 1 Nattokinase activity of different strains U/mL

    2.3 納豆激酶產(chǎn)生菌生長曲線的測定

    納豆激酶產(chǎn)生菌N-2的生長曲線見圖3,N-2菌在0~8 h時生長緩慢,處于生長延滯期;在8~12 h時活菌數(shù)量快速增加,處于對數(shù)生長期;在12~24 h處于生長穩(wěn)定期;24 h之后進(jìn)入生長衰亡期。

    圖3 N-2菌株生長曲線Fig.3 Growth curve of N-2 strain

    2.4 納豆制作及感官評價

    分別利用N-1,N-2,N-3,N-4,1-44菌株發(fā)酵制備納豆。并按照相應(yīng)的評價指標(biāo)對大豆進(jìn)行品評打分,比較結(jié)果見圖4。

    圖4 不同菌株發(fā)酵納豆指標(biāo)比較Fig.4 Comparison of the indexes of natto fermented by different strains

    結(jié)果顯示:N-2菌株發(fā)酵納豆拉絲、口感和氣味等指標(biāo)都優(yōu)于其他菌株;1-44菌株發(fā)酵納豆色澤黃褐色,半透明狀,優(yōu)于其他菌株;其中用N-2菌株發(fā)酵制得的納豆拉絲長度為80 cm,且醬豆味更香濃;用1-44菌株發(fā)酵的納豆拉絲長度為30 cm,香味也稍次于N-2菌株發(fā)酵的納豆。通過對發(fā)酵納豆綜合評價,N-2優(yōu)于其他菌株。

    N-2發(fā)酵結(jié)果及拉絲見圖5,N-2發(fā)酵制得的納豆初始為黃褐色,后熟結(jié)束顏色稍變深,口感酥軟,帶有獨特的醬香味,沒有胺臭味,攪動納豆時其表面的乳白色粘液增多,可以拉出長長的強韌不易斷的拉絲。

    圖5 N-2菌株發(fā)酵的納豆Fig.5 Natto fermented by N-2 strain

    注:左圖為三角瓶發(fā)酵納豆;右圖為納豆拉絲。

    2.5 高產(chǎn)納豆激酶產(chǎn)生菌的鑒定

    2.5.1 形態(tài)觀察

    N-2菌株的菌落形態(tài)近似圓形,邊緣不整齊或裂成葉狀,乳白色不透明,且表面有褶皺。對N-2菌株進(jìn)行芽孢染色觀察,顯微觀察結(jié)果見圖6,菌體呈短桿狀,兩端鈍圓,產(chǎn)芽孢,芽孢呈柱狀或橢圓形,芽孢中生,芽孢囊不明顯膨大;革蘭氏染色陽性。

    圖6 N-2菌株革蘭氏染色Fig.6 Gram's stain of N-2 strain

    2.5.2 生理生化鑒定

    對N-2菌株的部分生理生化特征進(jìn)行測定,結(jié)果見表2。

    表2 N-2菌株生理生化測定Table 2 Physiological and biochemical determination of N-2 strain

    2.5.3 N-2菌株16S rDNA同源性分析

    將N-2菌株16S rDNA測序結(jié)果在RDP 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,利用Classifier功能比對,結(jié)果顯示:N-2菌株屬厚壁菌門,類桿菌綱,芽孢桿菌目,芽孢桿菌科,芽孢桿菌屬;通過Seqmatch功能,將16S rDNA測序結(jié)果提交比對,結(jié)果顯示:N-2菌株與GenBank中的模式菌株解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensDSM7同源性達(dá)到99%。

    2.5.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

    根據(jù)Seqmatch比對結(jié)果,選擇與N-2菌株同源性較高的模式菌株16S rDNA 序列,用軟件MEGA 7.0鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行1000次步長計算,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖7)。在該系統(tǒng)發(fā)育樹上可見,N-2與GenBank中模式株BacillusamyloliquefaciensDSM7和BacillusamyloliquefaciensNBRC聚在同一個分支,驗證可信度達(dá)89%。由以上分析可知,N-2是一株Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)。

    圖7 N-2菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of N-2 strain

    注:樹枝上的數(shù)值為驗證可信度;圖下端標(biāo)尺表示堿基置換頻率;上標(biāo)T表示菌株為模式菌株。

    2.6 納豆激酶產(chǎn)生菌N-2菌株培養(yǎng)條件對酶活性的影響

    2.6.1 培養(yǎng)基初始pH值對納豆激酶活性的影響

    培養(yǎng)基不同初始pH,搖瓶發(fā)酵24 h后,分別測量相對酶活,結(jié)果見圖8。培養(yǎng)基初始pH值為6.0時的相對酶活最高,pH值為9時相對酶活最低。經(jīng)方差分析,培養(yǎng)基5個不同初始pH值,發(fā)酵結(jié)束后,酶活差異極顯著。經(jīng)多重比較,Duncan檢驗分析,結(jié)果顯示:初始pH值為6的培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束酶活極顯著高于其他處理;pH值為5的培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)束酶活顯著高于pH值為9的培養(yǎng)基;其他初始值之間發(fā)酵結(jié)束兩兩比較,均顯示酶活差異極顯著。

    圖8 培養(yǎng)基初始pH對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.8 Effect of initial pH of culture medium on nattokinase activity of N-2 strain

    注:小寫字母表示顯著度為P<0.05;大寫字母表示顯著度為P<0.01,下同。

    2.6.2 發(fā)酵溫度對納豆激酶活性的影響

    N-2菌株經(jīng)5個不同的培養(yǎng)溫度,分別培養(yǎng)發(fā)酵24 h,實驗結(jié)果見圖9。35 ℃時的相對酶活最高,25 ℃發(fā)酵相對酶活最低。經(jīng)方差分析,5個培養(yǎng)溫度經(jīng)發(fā)酵24 h后,25 ℃與40 ℃發(fā)酵結(jié)束,酶活差異不顯著;28 ℃與40 ℃發(fā)酵結(jié)束,酶活差異顯著;35 ℃和37 ℃溫度與其他發(fā)酵溫度相比,均顯示酶活差異極顯著。

    圖9 發(fā)酵溫度對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on nattokinase activity of N-2 strain

    2.6.3 不同鹽離子對納豆激酶活性的影響

    N-2菌株以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加一定量鹽,培養(yǎng)發(fā)酵24 h,實驗結(jié)果見圖10。與其他鹽相比,Ca2+對產(chǎn)酶的影響效果極顯著,其他鹽之間對產(chǎn)酶的影響效果不顯著。

    圖10 鹽離子對N-2菌株納豆激酶酶活的影響Fig.10 Effect of salt ions on nattokinase activity of N-2 strain

    對以上實驗結(jié)果進(jìn)行分析,初步確定較佳的培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基初始pH 6.0,加入適量Ca2+鹽,發(fā)酵溫度35 ℃。在此培養(yǎng)條件下使用N-2菌進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)酶,測得菌液的酶活為1365 U/mL。

    3 討論

    本實驗從傳統(tǒng)調(diào)味品中分離納豆激酶產(chǎn)生菌,對篩選出的幾株纖溶活性高的菌株進(jìn)行了納豆發(fā)酵,并對納豆進(jìn)行了評分比較。其中,N-2菌株各指標(biāo)綜合評價分值最高,該菌株發(fā)酵納豆性狀較優(yōu)。發(fā)酵初始pH及供氧對納豆激酶酶活影響極顯著??赏ㄟ^改變培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基營養(yǎng)組成優(yōu)化產(chǎn)酶條件,提高納豆激酶酶活。另外,可通過誘變或基因工程方式對菌種進(jìn)行選育,提高納豆激酶產(chǎn)量。

    市售納豆及納豆激酶存在的突出問題:大多市售納豆都有稍許胺臭味,有少部分人能接受食用;納豆和納豆激酶產(chǎn)品牽涉到納豆激酶酶活,其產(chǎn)品的貨架期相對其他調(diào)味品或保健品的貨架期短;菌株納豆激酶產(chǎn)量低。該實驗進(jìn)一步的研究內(nèi)容主要從以下幾個方面著手,納豆發(fā)酵優(yōu)化、延長產(chǎn)品的貨架期和提高N-2菌株的產(chǎn)酶量等方面。

    4 結(jié)論

    本實驗從傳統(tǒng)豆豉中篩選出的納豆激酶產(chǎn)生菌編號為N-2的菌株,對其進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析等項目的測定;鑒定結(jié)果初步認(rèn)定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。N-2菌株纖溶活性高,其納豆發(fā)酵性狀最佳,納豆拉絲長達(dá)80 cm,其酶活達(dá)到1159 U/mL,該菌最適的單因素液體發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH 6.0,添加0.02%濃度的 Ca2+鹽,發(fā)酵溫度35 ℃。在該條件下進(jìn)行液體發(fā)酵,其酶活為1365 U/mL,酶活比之前提高了18%。解淀粉芽孢桿菌是公認(rèn)的益生菌,而且該菌株又來源于食品,因此,N-2菌株可用于保健豆豉和納豆的生產(chǎn)和開發(fā),但作為納豆激酶生產(chǎn)菌商品開發(fā),該菌株的酶活有待進(jìn)一步提高。

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