抵當(dāng)湯調(diào)控深靜脈血栓形成大鼠Th1/Th2信號漂移的實(shí)驗(yàn)研究

安 震 張 玥 張玉冬 侯光敏

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250014； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院周圍血管病科，山東濟(jì)南250014）

近年來，深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）的發(fā)病率逐年上升，隨著對本病發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，炎癥在DVT中的作用越來越受到重視[1]。有學(xué)者提出DVT形成的關(guān)鍵事件最有可能是靜脈壁的炎癥[2]。炎癥細(xì)胞因子作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)，能夠通過誘導(dǎo)組織因子的表達(dá)促進(jìn)血液的高凝狀態(tài)，在DVT中起著重要的作用。輔助性T細(xì)胞（Th）的兩種亞型Th1和Th2細(xì)胞分別分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（INF-γ）等促炎因子和白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）等抗炎因子，這些因子的失衡導(dǎo)致Th1/Th2的漂移，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展。本研究以動物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，從分子生物學(xué)的角度探討Th1/Th2在DVT中的變化規(guī)律以及中藥抵當(dāng)湯的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠120只，12周齡，體重200～250g，清潔級，購自山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號：SCXK魯20130009）。1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 抵當(dāng)湯的四味藥物均購于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，依據(jù)《傷寒論》記載的劑量，折算后大黃45g、炒水蛭40g、炒虻蟲10g、桃仁6g。湯液濃縮后折算藥物濃度為2g/mL，4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 TNF-α、IL-4和IL-10的 大 鼠 放免試劑盒，北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司；大鼠IFN-γ ELISA試劑盒，R&D進(jìn)口分裝，上海門碟塔生物有限公司；水合氯醛，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 DDL-5冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SN-695型智能放射免疫γ測量儀，上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；WT11001R型電子天平，江蘇省常州市萬得天平儀器廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 采用Rryers法[3]。用10%的水合氯醛按3mL/kg體重腹腔麻醉后，動物取仰臥位，腹中部皮膚去毛，碘伏消毒2遍，鋪無菌巾。做劍突下腹正中切口，長6cm，將腹腔腸管移出體外，用濕紗布包裹后置于右腹部。打開后腹膜，仔細(xì)游離左腎靜脈與下腔靜脈匯合處，用4#外科非吸收性絲線于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈，1#外科非吸收性絲線結(jié)扎左腎靜脈水平以遠(yuǎn)下腔靜脈段的主要屬支，將外置腸管回納腹腔，1#絲線縫合腹壁和皮膚，給予腹腔注射青霉素10萬單位/只，4h后成功建立DVT大鼠模型。此法一般在結(jié)扎后3h血栓形成率為60%～80%，結(jié)扎后6h血栓形成率為100%[3]。課題組前期在進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)時，采用Rryers法造模4h后肉眼下均發(fā)現(xiàn)有血栓形成。

2.2 分組與給藥 將120只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、抵當(dāng)湯小劑量組和抵當(dāng)湯大劑量組，每組30只。各組大鼠又分別按照術(shù)后第1、3、7日處死時間的不同隨機(jī)平均分籠飼養(yǎng)，每籠10只。假手術(shù)組按照下腔靜脈造模術(shù)的方法分離出下腔靜脈后，不予以結(jié)扎，而后關(guān)腹。術(shù)后4h開始每日給藥。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃，每日1mL/100g，1次/d；抵當(dāng)湯大、小劑量組分別每日予1.8、0.9g/100g藥液灌胃，1次/d。

2.3 取材 分別于術(shù)后第1、3、7日取相應(yīng)籠中的大鼠，最后一次灌胃2h后，腹腔麻醉，開腹，操作同造模方法，腹主動脈取血，立即置于不加抗凝劑的試管內(nèi)，于30min內(nèi)送核醫(yī)學(xué)科離心后保存待測。

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 血清TNF-α、IL-4、IL-10 取腹主動脈血2mL，注入普通塑料試管內(nèi)，4℃、離心半徑17.8cm、3000r/min離 心10min，離 心 血清，-20℃保存?zhèn)溆?。測定前使樣本置于室溫或冷水中復(fù)融，再次4℃、離心半徑17.8cm、3000r/min離心5min，取上清液測定。

2.4.2 血漿IFN-γ 取腹主動脈血2mL，注入含EDTA的試管內(nèi)，離心半徑17.8cm、3000r/min離心30min去除顆粒，-20℃保存?zhèn)溆谩y定前至室溫中復(fù)融，采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)資料用（±s）形式表示，采用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠均有因麻醉過量、相互咬傷、手術(shù)操作不當(dāng)以及其他原因而未能獲得標(biāo)本就已經(jīng)死亡的情況，剩余只數(shù)見表1、表2。

表1 各組大鼠干預(yù)各時期血清TNF-α、IL-4、IL-10，血漿IFN-γ水平比較（±s）

表1 各組大鼠干預(yù)各時期血清TNF-α、IL-4、IL-10，血漿IFN-γ水平比較（±s）

注： 與假手術(shù)組比較，**P＜0.01 ；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 ；與抵當(dāng)湯大劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與本組術(shù)后第1日比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與本組術(shù)后第3日比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別 時間 動物數(shù)（只） T N F-α（n g/m L） I F N-γ（p g/m L） I L-4（p g/m L） I L-1 0（n g/m L）假手術(shù)組術(shù)后第1日 1 0 1.5 7±0.1 4 2 1 6.1 6±0.4 1 2 4 4 6.1 3±6.6 4 0 2 9.6 7±2.1 8 6術(shù)后第3日 9 1.6 0±0.1 5 6 1 7.9 6±1.5 3 1 4 5 1.6 1±8.0 3 5 3 1.4 2±1.4 8 1術(shù)后第7日 9 1.5 2±0.0 9 8 1 6.5 6±0.9 3 9 4 5 8.4 4±1 1.1 8 9 3 3.4 8±1.5 9 2模型組術(shù)后第1日 9 2.1 0±0.1 6 8** 2 6.8 9±1.7 8 0** 4 8 9.9 7±1 3.4 4 9** 3 6.4 3±1.3 6 6**術(shù)后第3日 9 2.4 1±0.1 4 9**## 3 4.1 7±4.4 6 2**## 5 0 4.1 2±1 0.7 6 9**# 3 8.4 1±2.0 2 1**#術(shù)后第7日 9 2.2 9±0.1 0 5**# 3 1.1 5±3.7 6 1**# 5 3 0.6 7±1 7.4 0 9**##☆☆ 4 1.7 6±2.6 6 5**##☆☆抵當(dāng)湯小劑量組術(shù)后第1日 9 1.8 5±0.1 5 9▲▲ 2 2.7 5±2.2 3 5▲▲△ 5 1 8.9 1±1 1.2 3 8▲▲△△ 4 0.7 8±4.4 7 7▲術(shù)后第3日 9 2.1 6±0.1 3 7▲▲△## 2 7.2 2±2.1 4 1▲▲△## 5 4 0.7 0±8.2 5 4▲▲△ 4 1.2 6±2.1 8 6▲△△術(shù)后第7日 8 2.0 2±0.1 4 1▲▲△# 2 5.5 1±2.9 5 8▲▲△△# 5 7 4.3 6±1 8.1 8 6▲▲△△ 4 7.3 2±1.5 9 2▲▲△△##☆☆抵當(dāng)湯大劑量組術(shù)后第1日 1 0 1.7 6±0.0 8 8▲▲ 2 0.7 0±1.5 1 2▲▲ 5 3 8.5 8±1 0.4 7 1▲▲ 4 2.0 5±1.0 4 8▲▲術(shù)后第3日 8 2.0 0±0.1 1 7▲▲## 2 4.9 6±2.1 1 2▲▲## 5 5 2.2 8±1 1.9 0 7▲▲# 4 9.8 5±1.9 0 7▲▲##術(shù)后第7日 8 1.8 7±0.1 1 5▲▲☆ 2 1.3 4±1.2 2 7▲▲☆☆ 6 0 5.8 1±1 1.9 3 9▲▲##☆☆ 5 1.9 7±1.6 4 8▲▲##☆

表2 各組大鼠干預(yù)各時期IL-10/TNF-α、IFN-γ/IL-4比值比較（±s）

表2 各組大鼠干預(yù)各時期IL-10/TNF-α、IFN-γ/IL-4比值比較（±s）

注： IFN-γ/IL-4比值數(shù)值過小，為了計算方便，表中數(shù)值為比值×100。與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與抵當(dāng)湯大劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與本組術(shù)后第1日比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與本組術(shù)后第3日比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01。

組別 時間 動物數(shù)（只） I L-1 0/T N F-α I F N-γ/I L-4假手術(shù)組術(shù)后第1日 1 0 2 0.5 3±1.9 6 6 3.6 2±0.3 2 9術(shù)后第3日 9 1 9.6 4±1.1 8 1 3.9 8±0.3 6 7術(shù)后第7日 9 2 0.7 3±1.5 9 2 3.6 1±0.5 0 5模型組術(shù)后第1日 9 1 7.3 5±2.2 1 1** 5.4 9±0.6 3 0**術(shù)后第3日 9 1 5.9 4±0.6 9 9** 6.7 8±0.6 8 6**##術(shù)后第7日 9 1 8.2 3±1.2 8 9**☆ 5.8 7±0.6 2 1**☆☆抵當(dāng)湯小劑量組術(shù)后第1日 9 2 2.0 4 3±1.7 7 8▲▲△ 3.9 9 8±0.1 7 4▲▲△△術(shù)后第3日 9 1 9.1 0 2±1.7 9 2▲▲△△ 5.0 3±0.8 9 5▲▲術(shù)后第7日 8 2 2.1 9±3.6 5 1▲▲△△☆ 4.4 4±0.7 3 6▲▲△抵當(dāng)湯大劑量組術(shù)后第1日 1 0 2 3.8 7 5±1.0 5 5▲▲ 3.4 7±0.3 3 0▲▲術(shù)后第3日 8 2 4.9 3±1.3 8 2▲▲ 4.5 2±0.8 3 7▲▲#術(shù)后第7日 8 2 7.7 9±1.8 8 8▲▲☆ 3.5 2 2±0.6 9 0▲▲☆

3.1 各組大鼠干預(yù)各時期血清TNF-α、IL-4、IL-10，血漿IFN-γ水平比較 結(jié)果見表1。說明抵當(dāng)湯對血栓引起的TNF-α、IFN-γ升高有抑制作用，且其作用表現(xiàn)出劑量依賴性；能劑量依賴性地升高IL-4、IL-10水平。各組大鼠TNF-α、IFN-γ水平隨手術(shù)的天數(shù)呈現(xiàn)先升高而后下降的趨勢，說明隨著血栓的形成，細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ水平逐漸升高，在術(shù)后第3天達(dá)到高峰，第7天時已逐漸下降。各組IL-4、IL-10水平隨手術(shù)的天數(shù)呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。

3.2 各組大鼠干預(yù)各時期IL-10/TNF-α、IFN-γ/IL-4比值比較 結(jié)果見表2。

4 討論

隨著近年來分子生物學(xué)的發(fā)展，對于DVT發(fā)病機(jī)制的研究越來越深入。越來越多的研究證明炎癥與DVT的發(fā)生密切相關(guān)。Th1和Th2是Mossman在1989年根據(jù)T細(xì)胞分泌因子的不同提出的兩個功能亞群，Th1和Th2細(xì)胞能夠分泌多種炎癥細(xì)胞因子，其中Th1分泌的TNF-α、IFN-γ具有促炎作用，Th2分泌的IL-4、IL-10具有抑炎作用[5]。正常情況下，Th1/Th2在體內(nèi)存在著動態(tài)平衡，當(dāng)Th1/Th2平衡失調(diào)并向某一狀態(tài)轉(zhuǎn)化時，稱之為Th1/Th2漂移現(xiàn)象[6]。習(xí)慣上把Th1及其細(xì)胞因子占優(yōu)勢的狀態(tài)稱為Th2向Th1漂移，反之Th2及其細(xì)胞因子占優(yōu)勢的狀態(tài)稱為Th1向Th2漂移。Th1/Th2漂移，能夠影響疾病進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，血栓形成后同一時相，模型組較假手術(shù)組TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10顯著升高，差異有非常顯著性（P＜0.01），說明在排除手術(shù)的原因后，血栓形成能引起TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10的升高。隨著天數(shù)的增加，IL-10/TNF-α比值在第3天變小，第7天增大，而IFN-γ/IL-4比值在第3天增大，第7天回落。說明血栓形成后，機(jī)體存在TNF-α、IFN-γ等促炎因子分泌增加，導(dǎo)致Th1占優(yōu)勢，Th2向Th1漂移，且在第3天達(dá)到高峰。這與DVT的臨床表現(xiàn)相一致：發(fā)病初期，隨著Th1細(xì)胞因子分泌的增加，機(jī)體的炎癥反應(yīng)明顯，表現(xiàn)為肢體紅腫熱痛；隨著病程的延長，Th2細(xì)胞因子分泌逐漸增加，下調(diào)靜脈壁的炎癥，表現(xiàn)為患肢紅腫熱痛減輕，血栓也趨于穩(wěn)定。

DVT屬于中醫(yī)學(xué)“股腫”“瘀血流注”范疇，臨床表現(xiàn)多有患肢的紅、腫、熱、痛，中醫(yī)辨證多屬瘀熱互結(jié)。DVT后瘀血阻于經(jīng)脈，氣血運(yùn)行不暢，瘀久化熱，熱邪又可傷津灼血，使血脈滯澀，即所謂“瘀積發(fā)熱”“留瘀化火”。“血不利則為水”，瘀血阻于脈中，營血回流受阻，導(dǎo)致津液代謝、輸布障礙，聚而為濕。瘀久化熱，熱邪灼津，煉液成痰。可見瘀和熱不僅是DVT過程中的病理產(chǎn)物，還是新的致病因素[7-8]。因此中醫(yī)治療當(dāng)以瀉熱逐瘀為主要治法。抵當(dāng)湯出自《傷寒雜病論》，由水蛭、虻蟲、桃仁、大黃四味藥物組成，是治療下焦蓄血證的經(jīng)典方劑。方中水蛭逐惡血破癥，具有破瘀血而不傷新血，專入血分而不傷氣分的特點(diǎn)；虻蟲入肝經(jīng)而專破瘀血；輔以活血祛瘀的桃仁，下瘀瀉熱的大黃，使瘀熱從下竅而泄。本研究結(jié)果顯示，抵當(dāng)湯治療后TNF-α、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值較模型組降低，IL-4、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值較模型組升高，且抵當(dāng)湯大劑量組的作用強(qiáng)于小劑量組。說明抵當(dāng)湯能劑量依賴性促進(jìn)Th2細(xì)胞因子的分泌，抑制Th1細(xì)胞因子分泌，使Th2向Th1漂移的狀態(tài)得到遏制和逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，本研究觀察了Th1和Th2在DVT中的比例變化及其特征性炎癥因子的表達(dá)。DVT存在Th1細(xì)胞因子分泌占優(yōu)勢，Th2向Th1漂移的現(xiàn)象。抵當(dāng)湯能劑量依賴性誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子的分泌，抑制Th1細(xì)胞因子表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療DVT的目的。下一步我們將通過研究Th1/Th2漂移調(diào)節(jié)機(jī)制，控制其分化的細(xì)胞因子微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)Th1/Th2漂移，最終實(shí)現(xiàn)控制炎癥，達(dá)到防治DVT的目的。