核黃素反應(yīng)性脂質(zhì)沉積性肌病一家系ETFDH基因突變研究

孔令恩， 莊順芝， 李才明， 陳禮錕， 張停亭， 邱金華， 周謙武， 蔡春生

脂質(zhì)沉積性肌病(LSM)是一組由于脂肪代謝中酶和(或)肉堿的缺陷而使異常增多的脂肪滴在肌纖維內(nèi)沉積導(dǎo)致的肌肉疾病。多種?；o酶A脫氫酶缺乏癥(MADD)又稱戊二酸尿癥Ⅱ型，是LSM 三大常見病因中的一種。MADD屬于常染色體隱性遺傳性疾病，是由于電子傳遞核黃素蛋白脫氫酶(ETFDH)基因或電子傳遞核黃素蛋白A/B基因發(fā)生突變所致[1]。MADD分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個亞型，其中Ⅲ型為青少年或成年起病，表現(xiàn)為核黃素反應(yīng)性LSM(RR-LSM)。研究表明[2,3]ETFDH是RR-LSM的主要突變基因。截止目前，國內(nèi)外已報道超過50個RR-LSM相關(guān)的ETFDH基因突變點[4]，其中約1/3的突變只見于中國人的報道。本研究對RR-LSM一家系進(jìn)行基因測序，探討該家系ETFDH基因的突變方式。

1 對象與方法

1.1 臨床資料 (1)RR-LSM家系 先證者為女性，75歲，廣東人，因“四肢無力4 y，加重1 m?！庇?017年5月收治于本科?；颊哂? y前開始無明顯誘因出現(xiàn)四肢無力，雙下肢明顯，下蹲后起立困難，上樓梯尤為明顯，平時行走300 m后即感覺下肢酸軟、費力，休息后可稍緩解，雙手上抬稍費力，尚能自行完成梳頭、洗臉等日?；顒樱? y前開始出現(xiàn)抬頭無力，無發(fā)熱、吞咽困難、咀嚼費力、呼吸困難等。1 y前曾在外院就診，查肌酸激酶示448 U/L，肌電圖提示肌源性損害，肌肉活檢提示：HE染色可見廣泛存在的肌纖維內(nèi)空泡，ORO染色示肌纖維內(nèi)大量紅染物質(zhì)沉積，考慮脂質(zhì)沉積性肌病可能，給予補充維生素B2治療，患者自覺上述癥狀明顯緩解，服用1 m后遂自行停藥。近1 m以來四肢無力癥狀加重，癥狀同前，為進(jìn)一步診治收入我科。既往有高血壓病史8 y，服用“絡(luò)活喜”降壓治療，血壓控制平穩(wěn)。足月順產(chǎn)，無窒息、高熱驚厥史。先證者的一個妹妹現(xiàn)年73歲，3 y前也開始出現(xiàn)與先證者類似的病史，服用維生素B2治療，效果明顯。除先證者及其妹妹外，整個家系中其他成員均無類似的表現(xiàn)，該家系譜(見圖1)。家族中無近親婚配史。入院體格檢查：先證者心肺腹查體無特殊。神經(jīng)系統(tǒng)檢查：意識清楚，查體合作，顱神經(jīng)查體陰性。四肢近端肌力4級，遠(yuǎn)端5級，四肢肌張力降低，腱反射減弱，病理征未引出，感覺系統(tǒng)檢查無異常，腦膜刺激征陰性。(2)正常對照者：100名，均為同期本院體檢中心的健康體檢者。入院后查先證者肌酸激酶712 U/L，3大常規(guī)、甲功5項、腫瘤4項、梅毒、HIV、乙肝兩對半、離子3項、肝腎功能、風(fēng)濕3項、血管炎5項、免疫8項均正常；肌電圖：肌源性損害。肝膽脾胰、泌尿系、子宮附件超聲檢查未見明顯異常。頭部+頸椎MRI平掃：雙側(cè)基底節(jié)區(qū)多發(fā)腔隙性梗死灶，頸椎MR平掃未見明顯異常。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 經(jīng)過惠州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，取得家系中4位成員(Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅲ3、Ⅳ2)和100位健康體檢者的知情同意后，用2%的EDTA抗凝管各抽取靜脈血3 ml。用DNA提取試劑盒(Promega，Madison，Wi，USA)提取上述個體基因組DNA。

1.2.2 DNA擴增 參照文獻(xiàn)[5]合成引物，擴增該家系4位成員ETFDH基因13個外顯子及其側(cè)翼系列。采用25 μl的反應(yīng)體系：上、下游引物各2 μl (5 μmol/μl)，DNA模板2 μl (50 ng)，DreamTaqTMGreen PCR Master mix (2×)12.5 μl，加雙蒸水至25 μl。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，然后95 ℃變性30 s，62～56 ℃退火30 s (從62 ℃開始，每個循環(huán)降低0.2 ℃，一直降至56 ℃)，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查。

1.2.3 DNA測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用ABI3730XL自動測序儀進(jìn)行直接測序。采用基因分析軟件Vector NTI 8.0比對分析測序結(jié)果。

2 結(jié) 果

基因測序顯示先證者及其妹妹第7號外顯子存在c.770A>G錯義突變，使第257位密碼子由TAT突變?yōu)門GT，導(dǎo)致正常的酪氨酸(Tyr)被半胱氨酸(Cys)替代(Y317C)；第10號外顯子存在c.1270_1273del缺失突變。先證者的兒子亦攜帶c.1270_1273del突變(見圖2)。先證者的孫子及100名健康體檢者均未見上述突變。

圖1 核黃素反應(yīng)性脂質(zhì)沉積性肌病家系圖

圖2 先證者及其妹妹、兒子ETFDH基因測序圖。先證者及其妹妹均存在c.770A>G和c.1270_1273del突變；先證者兒子存在c.1270_1273del突變。紅色箭頭所指為c.770A>G突變位置；黑色箭頭所指為c.1270_1273del突變所在的位置

3 討 論

本家系的先證者以四肢無力為主訴，以近端為主，嚴(yán)重時出現(xiàn)抬頭無力，肌酸激酶升高，肌電圖提示肌源性損害，考慮肌肉系統(tǒng)疾病；隨后的肌活檢證實為脂質(zhì)沉積性肌病，對維生素B2治療效果明顯，故考慮為RR-LSM。基因檢測證實先證者ETFDH基因存在突變，結(jié)合患者的發(fā)病年齡和臨床表現(xiàn)，診斷為MADDⅢ型。RR-LSM的表現(xiàn)多樣，常見的癥狀包括四肢近端無力、運動不耐受、咀嚼肌無力、頸肌無力[6～8]等，少見的可表現(xiàn)為呼吸困難[6]或橫紋肌溶解[9]的癥狀。基因檢測出2例患者均同時存在c.770A>G和c.1270_1273del突變，其中c.770A>G已經(jīng)被諸多文獻(xiàn)[5,10～11]證實為致病性突變。該突變使第257位密碼子由TAT突變?yōu)門GT，導(dǎo)致正常的酪氨酸(Tyr)被半胱氨酸(Cys)替代(Y317C)，從而導(dǎo)致蛋白功能缺失。王韻[5]等在2011年報道過中國北方地區(qū)20個RR-LSM家系，其中9個家系檢測出c.770A>G突變，故提出c.770A>G可能為北方地區(qū)的熱點突變，然而本家系世代久居南方地區(qū)，家系中多人出現(xiàn)c.770A>G突變，故本研究證實該突變并沒有明顯的地區(qū)差異。c.1270_1273del突變既往文獻(xiàn)未見報道，100名健康人群中亦未篩查出該突變，結(jié)合該病的遺傳方式，故我們推測該突變?yōu)樾掳l(fā)的致病性突變，進(jìn)一步拓寬ETFDH基因突變譜。該c.1270_1273del突變?nèi)绾斡绊懙降鞍坠δ苡写δ軐W(xué)檢測進(jìn)一步研究。目前國內(nèi)外雖有較多的RR-LSM的報道，但發(fā)病年齡以青少年或成年為主，本家系的2例患者的發(fā)病年齡分別為71歲、70歲，如此高齡才發(fā)病尚未見相關(guān)的文獻(xiàn)報道，我們推測患者發(fā)病年齡晚可能與c.1270_1273del突變導(dǎo)致蛋白功能缺陷程度較輕，從而使得發(fā)病年齡較晚有關(guān)，不過具體的機制還有待進(jìn)一步研究證實。RR-LSM為常染色體隱性遺傳，本家系兩姐妹先后發(fā)病，根據(jù)遺傳學(xué)規(guī)律，推測2例患者的突變基因均來源于父母雙方，可惜的是患者雙親已經(jīng)去世，未能得到進(jìn)一步證實。為進(jìn)一步明確患者的子女中是否攜帶ETFDH基因相關(guān)突變，做好遺傳咨詢，我們對家系的部分成員—先證者的兒子(Ⅲ3)及孫子(Ⅳ2)進(jìn)行基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者的兒子(Ⅲ3)亦攜帶c.1270_1273del突變，為RR-LSM攜帶者，先證者的孫子(Ⅳ2)未發(fā)現(xiàn)上述2個突變。由于RR-LSM患者對核黃素(維生素B2)有顯著的效果，口服維生素B2治療后患者的臨床癥狀及體征可迅速緩解或治愈，操基清[6]等提出對于臨床疑似RR-LSM患者，可考慮嘗試使用核黃素診斷性治療。