腎素—血管緊張素系統(tǒng)RAS在慢性應(yīng)激狀態(tài)下胰島素分泌中的作用

鄒雨桐　張智博　宋佩

[摘要] 目的 研究腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)下的大鼠胰島素分泌中所起作用。 方法 將20只SD大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照、電擊組、卡托普利（captopril）處理加電擊、坎地沙坦（candesartan）處理加電擊。3個(gè)需要電擊處理組連續(xù)電擊4周，4組大鼠定期測(cè)量血壓，在電擊結(jié)束后行腹腔注射葡萄糖耐量（IPGTT）實(shí)驗(yàn)，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定大鼠血糖水平，處死后收集血清和胰臟，測(cè)定血清中血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）和胰島素水平，用Q-PCR測(cè)定各組大鼠的Pcsk1基因和Pcsk2基因的表達(dá)情況。 結(jié)果 在慢性應(yīng)激情況下，只經(jīng)電擊處理的大鼠血壓和血清血管緊張素Ⅱ水平均高于對(duì)照組大鼠的正常水平（P<0.05）；分別經(jīng)過(guò)血管緊張素Ⅱ受體（AT1）拮抗劑-坎地沙坦（candesartan）和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑-卡托普利（captopril）處理的兩個(gè)組，大鼠的血壓及Ang Ⅱ水平均低于對(duì)照組水平（P<0.05）。3組電擊處理過(guò)的大鼠血清胰島素水平均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。電擊4周后的IPGTT顯示，4組大鼠的糖耐量水平表現(xiàn)無(wú)顯著差異。3個(gè)電擊處理組大鼠Pcsk1基因的表達(dá)相比對(duì)照組明顯降低（P<0.05），各組大鼠Pcsk2基因表達(dá)無(wú)明顯差異。 結(jié)論 在慢性應(yīng)激4周的情況下，大鼠胰島素分泌出現(xiàn)顯著下降，卡托普利（captopril）和坎地沙坦（candesartan）處理并未改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)引起的胰島素分泌下降，因此，RAS系統(tǒng)可能未參與慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島素分泌下降。

[關(guān)鍵詞] 腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）；應(yīng)激；胰島素；糖尿病

[中圖分類號(hào)] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）20-0036-05

The role of renin-angiotensin system（RAS） in insulin secretion under chronic stress

ZOU Yutong1 ZHANG Zhibo1 SONG Pei1 XU Qun1 ZHANG Guoxing2

1.The First School of Clinical Medicine， Suzhou University School of Medicine， Suzhou 215123， China； 2.Faculty of Physiology， School of Basic Medicine and Life Sciences， Suzhou University School of Medicine， Suzhou 215123， China

[Abstract] Objective To study the role of renin-angiotensin system（RAS） in the insulin secretion of rats induced by chronic stress. Methods 20 SD rats were randomly divided into 4 groups： a normal control group， a shock group， captopril treatment plus electric shock， and candesartan treatment plus electric shock. Three groups which needed electric shocks were given electric shock for 4 weeks consecutively. Four groups of rats were regularly given measurement of blood pressure. At the end of the shock， an intraperitoneal glucose tolerance test（IPGTT） was performed. The rats' blood glucose levels were measured at the corresponding time points. Serum and pancreas were collected after sacrifice. The serum angiotensin Ⅱ（Ang Ⅱ） and insulin levels were measured， and the expression of Pcsk1 gene and Pcsk2 gene in each group of rats was determined by Q-PCR. Results Under chronic stress conditions， the blood pressure and serum angiotensin Ⅱ levels in rats treated with electroshock were higher than the normal levels in the rats from the control group（P<0.05）； in group treated with angiotensin Ⅱ receptor（AT1） antagonists-candesartan and angiotensin converting enzyme inhibitor-captopril respectively， the blood pressure and Ang Ⅱ levels in rats were lower than those in the control group（P<0.05）. The serum insulin levels in rats treated with electroshock in the three groups were significantly lower than those in the control group（P<0.05）. IPGTT after 4 weeks of electroshock showed no significant difference in glucose tolerance levels between the four groups. Compared with the control group， the expression of Pcsk1 gene in the three electroshock groups was significantly lower（P<0.05）. There was no significant difference in the expression of Pcsk2 gene between all groups. Conclusion In the case of chronic stress for 4 weeks， insulin secretion is significantly reduced in rats. Treatment with captopril and candesartan do not improve the reduction of insulin secretion induced by chronic stress induction. Therefore， RAS system may not be involved in the chronic stress-induced decrease in insulin secretion.

[Key words] Renin-angiotensin system（RAS）； Stress； Insulin； Diabetes

近40年來(lái)，我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展迅猛，人口老齡化趨勢(shì)明顯，糖尿病等多發(fā)生于老年人群的代謝性疾病發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著增高的趨勢(shì)，當(dāng)前我國(guó)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有15.5%患有糖尿病[1]。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）作為一種臨床常見(jiàn)的糖尿病類型，是以胰島 B細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗為主要病理生理改變的代謝性疾病，目前認(rèn)為由遺傳和環(huán)境因素互相作用引起。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島 B細(xì)胞功能缺陷在糖尿病的發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色[2]。胰島素抵抗是機(jī)體對(duì)一定量或濃度的胰島素的生物效應(yīng)減低，主要指機(jī)體由胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取和代謝能力減弱，包括胰島素的敏感性下降和反應(yīng)性下降[3]。有關(guān)T2DM胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，一直是研究的熱點(diǎn)。本文將討論慢性應(yīng)激引起的胰島素分泌不足及RAS系統(tǒng)在其中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用20只SD大鼠，蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SYXK（蘇）2017-0043]，均為雄性，體重200～250 g，喂養(yǎng)條件如下：5只一籠，室溫25℃，濕度50%～60%，通風(fēng)良好，自由攝食、飲水，常規(guī)日夜周期環(huán)境下實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)所用藥物為血管緊張素Ⅱ受體1阻斷劑坎地沙坦（candesartan）（成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，AR，99.0%，1g，CAS：145040-37-5）及血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利（captopril）[東京化成工業(yè)株式會(huì)社，>98.0%（HPLC）（T），CAS：62571-86-2]，將藥物溶解即可使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

將SD大鼠隨機(jī)平均分為4組（n=5）：對(duì)照組、電擊組、卡托普利（captopril）處理加電擊組、坎地沙坦（candesartan）處理加電擊組。藥物處理組每天上午給藥（劑量為卡托普利100 mg/kg，坎地沙坦10 mg/kg），三個(gè)電擊處理組每天上午和下午電擊，一次持續(xù)2 h，共電擊4周，期間定期測(cè)量大鼠血壓。電擊的最后1 d，電擊完成后禁食，取血清第2天進(jìn)行IPGTT試驗(yàn)，隨后處死大鼠，取胰腺進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）血壓測(cè)定：每7天采用尾袖法通過(guò)無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)定清醒安靜狀態(tài)下的各組大鼠尾動(dòng)脈的收縮壓和心率。測(cè)量血壓前將大鼠預(yù)置于37℃的恒溫箱中，持續(xù)10～20 min，使其尾部動(dòng)脈擴(kuò)張便于測(cè)量。在動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境、行為穩(wěn)定后，開(kāi)始測(cè)量，連續(xù)測(cè)3次，取其均值。（2）IPGTT：在腹腔注射葡萄糖前和腹腔注射葡萄糖后的10 min、15 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量血糖。（3）血清：使用試劑盒測(cè)定大鼠血清中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）和胰島素的含量。（4）Q-PCR：研磨和勻漿樣品，提取總mRNA，以mRNA為模板，采用Oligo隨機(jī)引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。再以cDNA作為模板配制PCR反應(yīng)體系，放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，設(shè)定好程序后開(kāi)始反應(yīng)，記錄CT值。具體步驟如下：以mRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，每個(gè)反應(yīng)體系共20 μL，SYBR Premix EX Taq Ⅱ（Tli RNasH Plus）（2×） 10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.8 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.8 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，RT反應(yīng)液（cDNA溶液）2 μL，ddH2O 6 μL。將準(zhǔn)備好的96孔板置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，設(shè)定好程序后開(kāi)始反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件為：（1）預(yù)變性階段：95℃ 2 min，1 cycle。（2）熱循環(huán)階段：95℃ 15 sec，60℃ 1 min，40 cycle。（3）溶解曲線：95℃ 15 sec，60℃ 15 sec，95℃ 15 sec，1 cycle。各基因引物如下。見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0 for Windows 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)差異，檢驗(yàn)組間差異進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓情況

從第7天開(kāi)始，對(duì)照組和電擊組血壓有明顯差異，第7天（t=3.138，P<0.05）、第14天（t=6.975，P<0.05）、第21天（t=11.879，P<0.05）和第28天（t=39.500，P<0.05）電擊組血壓均高于對(duì)照組。第7天開(kāi)始，卡托普利處理加電擊組血壓明顯低于電擊組（t=4.808，P=0.01<0.05），此后第14天（t=5.769，P<0.05）、第21天（t=19.269，P<0.05）、第28天（t=7.538，P<0.05）卡托普利處理加電擊組血壓均低于電擊組。

第7天開(kāi)始，坎地沙坦處理加電擊組血壓明顯低于電擊組（t=7.931，P<0.05），此后第14天（t=8.406，P<0.05）、第21天（t=12.612，P<0.05）、第28天（t=46.040，P<0.05）坎地沙坦處理加電擊組血壓均低于電擊組。

以上結(jié)果表明電擊組導(dǎo)致大鼠血壓升高，卡托普利和坎地沙坦有降血壓的作用。見(jiàn)圖1及表2。

2.2 大鼠血清Ang Ⅱ情況

比較各組大鼠血清Ang Ⅱ情況，與對(duì)照組大鼠血清Ang Ⅱ（5.39±0.51 ng/mL）相比，電擊組大鼠血清Ang Ⅱ（8.75±0.80 ng/mL）顯著升高（t=3.569，P<0.05），與電擊組大鼠血清Ang Ⅱ（8.75±0.80 ng/mL）相比，卡托普利處理加電擊組（2.10±0.32 ng/mL）（t=7.752，P<0.05）及坎地沙坦處理加電擊組（2.73±0.44 ng/mL）（t=6.633，P<0.05）顯著降低，可見(jiàn)兩藥物阻斷RAS系統(tǒng)而且效果明顯。見(jiàn)圖2。

2.3 IPGTT各組血糖情況

在注射葡萄糖溶液之前測(cè)血糖發(fā)現(xiàn)對(duì)照組高于電擊組（t=3.000，P<0.05），卡托普利處理加電擊組與電擊組無(wú)明顯差異，坎地沙坦處理加電擊組血糖值比電擊組高（t=7.608，P<0.05）。

在腹腔注射葡萄糖后，各組血糖在15 min達(dá)到峰值，峰值時(shí)坎地沙坦處理加電擊組高于電擊組，高于卡托普利處理加電擊組，對(duì)照組最低，電擊組血糖水平顯著高于對(duì)照組（t=2.530，P<0.05）。隨后血糖下降的過(guò)程，對(duì)照組下降較慢，卡托普利處理加電擊組下降較快。60 min時(shí)，對(duì)照組血糖水平顯著高于電擊組（t=3.968，P<0.05），卡托普利處理加電擊組血糖水平顯著低于電擊組（t=2.601，P<0.05），坎地沙坦處理加電擊組與電擊組無(wú)明顯差異。90 min時(shí)，對(duì)照組血糖水平顯著高于電擊組（t=2.640，P<0.05），卡托普利處理加電擊組血糖水平顯著低于電擊組（t=3.833，P<0.05）。120 min時(shí)，對(duì)照組血糖水平和電擊組無(wú)明顯差異，卡托普利處理加電擊組血糖水平顯著低于電擊組（t=3.503，P<0.05）。見(jiàn)圖3及表3。

2.4 大鼠血清胰島素情況

比較各組大鼠血清胰島素水平，相比于對(duì)照組（9.15±0.22 μg/L），電擊組（6.83±0.28 μg/L）（t=6.526，P<0.05）、卡托普利處理加電擊組（6.28±0.74 μg/L）（t=3.746，P<0.05）和坎地沙坦處理加電擊組（6.47±0.58 μg/L）（t=4.360，P<0.05）血清胰島素水平均明顯低于對(duì)照組。見(jiàn)圖4。

2.5 大鼠Pcsk1和Pcsk2基因表達(dá)情況

比較各組大鼠Pcsk1基因的表達(dá)情況，相比對(duì)照組（1.23±0.09），電擊組（0.98±0.06）（t=3.754，P<0.05）、卡托普利處理加電擊組（0.92±0.06）（t=4.421，P<0.05）及坎地沙坦處理加電擊組（0.84±0.07）（t=5.390，P<0.05）三組Pcsk1表達(dá)明顯降低，各組大鼠Pcsk2基因表達(dá)無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖5。

3 討論

關(guān)于糖尿病發(fā)病的兩種機(jī)制，胰島素抵抗和胰島B細(xì)胞功能障礙均可以導(dǎo)致血糖水平升高，胰島B細(xì)胞的功能障礙可引起高血糖，而高血糖又加重胰島B細(xì)胞的功能障礙[4]。胰島B細(xì)胞功能障礙在糖尿病早期是可逆的，因此在疾病早期需通過(guò)及時(shí)控制血糖水平、保護(hù)胰島B細(xì)胞功能，使胰島B細(xì)胞功能得到最大程度的恢復(fù)[5]。但隨著疾病的進(jìn)展，由于細(xì)胞凋亡等原因?qū)е乱葝uB細(xì)胞總量減少，直至其功能損害無(wú)法逆轉(zhuǎn)[6]。

慢性應(yīng)激（Unpredictable chronic mild stress）長(zhǎng)期以來(lái)被用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)制造抑郁導(dǎo)致的身體機(jī)能紊亂的模型，是一種可靠的模擬方法，其中就包括胰島素分泌異常，而且有調(diào)查顯示這種應(yīng)激會(huì)引起抑郁進(jìn)而增加個(gè)體患糖尿病的可能性[7，8]。另外有研究顯示慢性應(yīng)激會(huì)影響胰島素分泌和導(dǎo)致糖耐量異常，而且會(huì)影響胰腺上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter-2，GLU2）的水平，導(dǎo)致胰島素抵抗[9，10]。

血管緊張素Ⅱ受體1阻斷劑坎地沙坦（candesartan）和血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑卡托普利（captopril）是常用的降血壓藥物。有研究顯示AngⅡ具有調(diào)節(jié)胰島素的生物學(xué)功能[11]，因?yàn)锳ngⅡ和胰島素有一段共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，AngⅡ激活A(yù)T1受體抑制胰島素通過(guò)PI3K途徑介導(dǎo)的葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、糖元合成等，可見(jiàn)RAS系統(tǒng)可以影響胰島素代謝[12]。Shiuchi等[13]研究發(fā)現(xiàn)ACEI使2型糖尿病小鼠骨骼肌細(xì)胞的2-去氧葡萄糖的攝取能力增加，另外有研究顯示ARB類藥物有改善胰島素調(diào)節(jié)的作用[14]。在臨床試驗(yàn)方面有卡托普利預(yù)防實(shí)驗(yàn)（Captopril prevention project，CAPPP）觀察到卡托普利控制高血壓的病人中新的2型糖尿病發(fā)病率低[15]，LIFE（Losartan intervention for endpoint reduction in hypertension study，2002）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氯沙坦使新發(fā)糖尿病發(fā)生率降低[16]，可見(jiàn)ARB及ACEI類藥物一定程度上可以改善胰島素代謝以及減少糖尿病的發(fā)生。

本研究顯示，慢性應(yīng)激使大鼠出現(xiàn)胰島素分泌不足的情況，RAS系統(tǒng)未參與此過(guò)程。實(shí)驗(yàn)使用無(wú)規(guī)律電擊的方法來(lái)模擬慢性應(yīng)激，經(jīng)過(guò)4周的電擊，電擊處理組的大鼠出現(xiàn)血清胰島素下降的情況，提示長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激導(dǎo)致胰島素分泌水平下降。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)主要是下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活，機(jī)體通過(guò)腺垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素，導(dǎo)致兒茶酚胺類物質(zhì)分泌增多[17]。兒茶酚胺動(dòng)員機(jī)體的脂肪、肝糖元和肌糖元，使胰高血糖素分泌增加，促進(jìn)糖元分解，同時(shí)又抑制胰島素的分泌。此外，長(zhǎng)期電擊可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)發(fā)生堆積或鈣離子平衡發(fā)生紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Bip（immunoglobulin binding protein）解離出來(lái)與未折疊蛋白或者錯(cuò)誤結(jié)合蛋白結(jié)合，使得由肌醇依賴酶IRE-1，活化轉(zhuǎn)錄因子ATF6和RNA 依賴的蛋白激酶樣激酶PERK參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被激活，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic recticulum stres）的發(fā)生[18，19]。胰島素從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開(kāi)始合成，胰島素原在此正確折疊，然后運(yùn)輸至高爾基體經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的加工，形成成熟的胰島素來(lái)發(fā)揮作用。錯(cuò)誤折疊的胰島素原等蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積，通過(guò) PERK介導(dǎo)的 elF2磷酸化和轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)ATF4及凋亡基因 CHOP的表達(dá)導(dǎo)致胰島B細(xì)胞死亡[20]。以上可能是胰島素分泌不足的機(jī)制。Pcsk1基因編碼的前蛋白轉(zhuǎn)化酶（Proprotein eonvertase 1，PC1）是胰島素源轉(zhuǎn)化為胰島素的一個(gè)重要關(guān)鍵酶，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)到電擊處理組的Pcsk1基因表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步證明慢性應(yīng)激影響導(dǎo)致胰島素分泌水平下降。

分析大鼠血壓和血清AngⅡ水平發(fā)現(xiàn)，電擊導(dǎo)致大鼠的血壓升高及血清AngⅡ水平的升高，卡托普利（captopril）和坎地沙坦（candesartan）成功阻斷了RAS系統(tǒng)導(dǎo)致兩給藥組的AngⅡ水平及血壓的降低，但是兩給藥組的Pcsk1基因表達(dá)水平與單純電擊組無(wú)明顯差異，而且兩給藥組的血清胰島素水平與單純電擊組也無(wú)明顯差異，提示阻斷RAS系統(tǒng)并未改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)引起的胰島素分泌不足。另外分析IPGTT實(shí)驗(yàn)情況，各組血糖在15 min時(shí)達(dá)到峰值，峰值時(shí)坎地沙坦處理加電擊組高于電擊組，高于卡托普利處理加電擊組，在血糖恢復(fù)的過(guò)程，卡普托利組恢復(fù)好于電擊組，坎地沙坦處理組與單純電擊組無(wú)明顯差異，對(duì)照組恢復(fù)情況最差，提示阻斷RAS系統(tǒng)并未改善胰島素分泌不足的情況，各組大鼠未出現(xiàn)糖尿病的表現(xiàn)。

綜上所述，在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)4周情況下，阻斷RAS系統(tǒng)不能改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的胰島素分泌不足。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行慢性應(yīng)激的時(shí)間為4周，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)胰島素分泌不足情況，但是因?yàn)槁詰?yīng)激時(shí)間較短，大鼠處于一種可代償?shù)臓顟B(tài)，而未出現(xiàn)糖尿病癥狀。

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（收稿日期：2018-04-13）