參苓水煎液對(duì)免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究

張喬，姜蘇洋，呂航，王博涵

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

中醫(yī)學(xué)關(guān)于“正氣存內(nèi)、邪不可干，邪之所湊、其氣必虛”的經(jīng)典論述中，“正氣”作為防御外邪入侵的高度功能概括，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫功能不謀而合。黨參在《本草正義》中有“補(bǔ)脾養(yǎng)胃，潤(rùn)肺生津，健運(yùn)中氣，本與人參不甚相遠(yuǎn)[1]?！避蜍呤驾d于《本草經(jīng)》，具有健脾補(bǔ)中、養(yǎng)心安神、利水滲濕之效[2]。黨參配茯苓，可補(bǔ)氣健脾，兼能除濕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，以上兩味中藥所含多種成分對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均具有顯著作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)上述兩味中藥對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能的影響[3]，來(lái)確立最顯著藥效的劑量應(yīng)用，以期能夠?yàn)樘岣邫C(jī)體免疫系統(tǒng)功能提供可參考的量化數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明KM小鼠SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g。普通級(jí)豚鼠，雄性，250～300 g，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。雌雄分開(kāi)喂養(yǎng)，室溫(20±2)℃，濕度50%～70%，采用晝夜間斷照明，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)環(huán)境2周。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857)；中華墨汁(哈爾濱泰信墨業(yè)有限公司)；綿羊紅細(xì)胞(北京博爾西科科技股份有限公司，批號(hào)161112)；二硝基氟苯(廣東惠令化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)160935)；黨參、茯苓(哈爾濱世一堂制藥廠飲片)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

WZ-2A微量振蕩器(北京海淀電子醫(yī)療儀器廠)；TG16A-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；UV-9100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器廠)；微量加樣器(德國(guó)Eppendor)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組(A)、模型對(duì)照組(B)、高劑量實(shí)驗(yàn)組(C)、低劑量實(shí)驗(yàn)組(D)。均灌胃生理鹽水0.2 ml/10 g，連續(xù)3天。第4天，A組皮下注射生理鹽水60 mg/kg，B、C、D組皮下注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg。然后A、B組灌胃給藥生理鹽水0.2 ml/10 g，連續(xù)3天，C組灌胃給藥水煎液0.2 ml/10 g，連續(xù)3天，D組灌胃給藥水煎液0.1 ml/10 g，連續(xù)3天。

2.2 對(duì)免疫器官重量的影響

40只小鼠按上述A、B、C、D組末次給藥后1 h，脫頸椎處死，取胸腺和脾臟精密稱取濕重。

按照如下公式計(jì)算臟器系數(shù)：

臟器系數(shù)=臟器重量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.3 對(duì)單核巨噬細(xì)胞的影響

另取40只小鼠按上述A、B、C、D組方法造模,末次給藥后1 h，從小鼠的尾靜脈注射已稀釋的中華墨汁0.05 ml/10 g，注射墨汁后2 min和10 min，分別對(duì)小鼠的內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并且立即將其加到2 ml的0.1% Na2CO3溶液中。以0.1% Na2CO3溶液作為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定血液樣本光密度OD值。然后斷頸處死小鼠，取肝臟和脾臟，分別稱重[4]。

按照以下公式計(jì)算碳廓清指數(shù)K，吞噬指數(shù)α。

K=(lgC1-lgC2)/(t2-t1)

α=W/WLS×K1/3

K為未經(jīng)校正的吞噬指數(shù)

W為體質(zhì)量

WLS為肝脾合重

C1為t1(2 min)時(shí)血樣本的光密度值

C2為t2(10 min)時(shí)血樣本的光密度值

2.4 對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

另取40只小鼠按上述A、B、C、D組灌胃給藥,第3天，每組10只小鼠，用硫化鋇均勻涂抹腹部皮膚進(jìn)行脫毛，然后用 DNFB溶液50 μL涂抹致敏。灌胃給藥第8天，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于每一組小鼠右耳雙面進(jìn)行致敏攻擊。攻擊后24 h脫頸處死小鼠，剪下左右耳。用打孔器取下直徑 8 mm的耳片，進(jìn)行稱重。用左右耳重量之差反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的強(qiáng)弱程度。

2.5 對(duì)體液免疫功能的影響

取豚鼠7只進(jìn)行補(bǔ)體制備，在飼喂前每只心頭取血10 ml左右于EP管中，在37℃恒溫箱中靜置30 min，后置在4℃冰箱內(nèi)，待血清析出，上離心機(jī)，3 000 rpm離心15 min，取上清液。

另取40只小鼠按上述A、B、C、D組灌藥第3天，每組取10只小鼠，腹腔注射10%的SRBC致敏，0.2 mL/只，每天給藥1次，連續(xù)給藥4天。致敏后第5天，眼眶內(nèi)眥靜脈叢采血制備血清。將血清樣本用生理鹽水500倍稀釋后，各組樣品管中分別加入1∶500試驗(yàn)小鼠血清稀釋液1 ml；10% SRBC 0.5 ml、以及1∶10補(bǔ)體血清稀釋液1 ml震蕩混勻，再另取空白管，分別加入等量的補(bǔ)體、SRBC及1 ml生理鹽水。然后將各管置于37℃水浴中孵育10 min，冰浴10 min后終止，2 000 rpm離心10 min，取上清液，在可見(jiàn)光分光光度計(jì)540 nm處測(cè)定各管OD值，記錄結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方水煎劑對(duì)免疫器官重量的影響

表1結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01)。低劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)在原始數(shù)據(jù)值上觀察有相應(yīng)的提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.01，P<0.05)。

表1 復(fù)方水煎劑對(duì)免疫器官重量的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 復(fù)方水煎劑對(duì)單核巨噬細(xì)胞的影響

表2結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α顯著降低(P<0.01)。低劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α在原始數(shù)據(jù)值上觀察有相應(yīng)的提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α顯著升高(P<0.01)。

表2 復(fù)方水煎劑對(duì)單核巨噬細(xì)胞的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 復(fù)方水煎劑對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

由表3結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的耳腫脹程度顯著降低(P<0.01)。低劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的耳腫脹程度無(wú)明顯差異(P>0.05)。高低劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的耳腫脹程度顯著升高(P<0.01)。

表3 復(fù)方水煎劑對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 復(fù)方水煎劑對(duì)體液免疫功能的影響

由表4結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠的型對(duì)照組小鼠血清中溶血素抗體的含量顯著降低降低(P<0.01)。低劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，低劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血液中溶血素抗體含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。高低劑量實(shí)驗(yàn)組與模型對(duì)照組相比，高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中溶血素抗體含量顯著升高(P<0.01)。

表4 復(fù)方水煎劑對(duì)體液免疫功能的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

環(huán)磷酰胺(CY)是臨床中常用一種免疫抑制劑，可殺死免疫細(xì)胞，影響巨噬細(xì)胞，同時(shí)抑制體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)[4-5]。因此CY誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠被用來(lái)研究藥物的免疫調(diào)節(jié)活性視為經(jīng)典方法[6]。本研究結(jié)果顯示，CY對(duì)照組小鼠的各項(xiàng)免疫檢測(cè)指標(biāo)均低于高、低劑量組(P<0.05)，表明成功建立免疫抑制動(dòng)物模型。

免疫器官根據(jù)發(fā)生的時(shí)間順序與功能差異分為中樞免疫器官與外周免疫器官兩部分。本實(shí)驗(yàn)選擇中樞免疫器官中的胸腺與外周免疫器官中的脾臟[7]。因胸腺可訓(xùn)化T細(xì)胞，脾臟是體內(nèi)形體最大的淋巴器官，富含T細(xì)胞，且是發(fā)生免疫應(yīng)答的靶向作用點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)參苓水煎液對(duì)免疫抑制模型小鼠免疫器官指數(shù)的影響，表明參苓水煎液高低劑量均可使已經(jīng)處于萎縮狀態(tài)的免疫器官恢復(fù)，并呈現(xiàn)劑量遞增趨勢(shì)。

吞噬作用一般用于評(píng)估動(dòng)物的非特異性免疫狀態(tài)[8]。巨噬細(xì)胞[9]的吞噬作用是最重要的，可防御所有類型的入侵細(xì)胞，還可通過(guò)分泌細(xì)胞因子和處理呈現(xiàn)抗原，間接發(fā)揮作用從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)研究表明，高、低劑量組參苓水煎液能增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并且高劑量組優(yōu)于低劑量組。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)又稱為IV型超敏反應(yīng)，是由單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)與組織細(xì)胞損傷為主要特征的反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的細(xì)胞免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)利用二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene,DNFB)為致敏原，先于小鼠腹部涂抹致敏，生成致敏淋巴細(xì)胞。再于致敏后第6天小鼠耳朵涂抹再次攻擊致敏，并于攻擊高峰段致敏后24 h進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知環(huán)磷酰胺可抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的進(jìn)行，高低劑量參苓水煎液均可拮抗環(huán)磷酰胺此功能，進(jìn)而增加遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強(qiáng)度。

體液免疫為機(jī)體特異性免疫，抗體形成細(xì)胞數(shù)量的多少可反映體液免疫功能的強(qiáng)弱。以往研究中IgM為體液免疫作用機(jī)制中對(duì)抗原最具親和力的抗體[10]，本實(shí)驗(yàn)即通過(guò)測(cè)定溶血素的OD值反映IgM的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高劑量組免疫抑制小鼠的溶血素含量有顯著提升，因此提示參苓水煎液可提高免疫抑制模型小鼠的體液免疫功能。

黨參有補(bǔ)中益氣之效，茯苓具健脾滲濕之功，二者合用，共奏補(bǔ)中健脾之性。脾主運(yùn)化，為運(yùn)行中氣，滋養(yǎng)四肢百骸之臟。而健運(yùn)脾陽(yáng)、補(bǔ)中益氣，可提升人體正氣和中氣，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中提高機(jī)體免疫力具有相通的作用和性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)將二者有機(jī)組合，進(jìn)行了不同劑量下配伍的免疫系統(tǒng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下的中藥藥效配伍可為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫系統(tǒng)研究提供樣本。