遼東楤木葉紅外光譜指紋圖譜分析

許樹軍，鄒淑君*，孫永慧，肖洪彬

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040)

遼東楤木[Araliaelata(Miq.) Seem.]為五加科楤木屬植物，廣泛分布于中國東北地區(qū)。其葉在嫩芽期可作為山野菜食用，葉中提取的皂苷具有良好抗腫瘤作用，且抗腫瘤作用機(jī)理明確[1-2]，毒理學(xué)研究證明遼東楤木葉醇提物口服安全、無毒副作用[3]。由于葉可再生，資源豐富，有效利用能帶來很大的經(jīng)濟(jì)效益，因此越來越受到人們重視，有望開發(fā)為新藥。本研究擬采用紅外光譜法對遼東楤木葉進(jìn)行指紋圖譜分析。與其他中藥分析方法相比，紅外光譜法具有簡便、快速、無損、成本低等特點(diǎn)[4-5]，近年來已被廣泛地應(yīng)用于中藥的各個領(lǐng)域。將紅外光譜分析法應(yīng)用于遼東楤木葉藥材分析，期望建立一種遼東楤木葉藥材質(zhì)量快速評價方法，并為遼東楤木葉采收時間提供指導(dǎo)。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)；SSP-10A型粉末壓片機(jī)(日本島津公司)；WS70-1型紅外線快速干燥箱(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實驗材料

20批不同產(chǎn)地、不同采收期的遼東楤木葉干燥藥材粉末(過100目篩)，具體見表1。藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)蘇連杰教授鑒定為五加科楤木屬植物遼東楤木(Araliaelata(Miq.) Seem.)的干燥葉。溴化鉀(光譜純)，其他試劑均為分析純。

表1 遼東楤木葉藥材信息

2 實驗方法

2.1 試樣制備

取遼東楤木葉粉末約5.0 g，置500 mL具塞錐形瓶中，加50%乙醇200 mL，密塞，超聲提取1 h后，放冷，過濾，置于蒸發(fā)皿中濃縮至固體，固體加水100 mL混懸，用等體積水飽和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，蒸干，得固體試樣，備用。

2.2 測試方法

溴化鉀壓片法測定室溫下的紅外光譜，取約3.0 mg試樣與0.2 g KBr置于瑪瑙研缽，在紅外干燥箱中研磨、壓片、于4 000～400 cm-1光譜范圍測試。

2.3 數(shù)據(jù)分析

用origin9.0作紅外圖譜，IR Solution Chinese 1.10(日本島津)紅外軟件進(jìn)行共有模式峰標(biāo)識及二階導(dǎo)數(shù)處理，SPSS19.0進(jìn)行相似度和聚類分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗

取2號藥材樣品，連續(xù)測定5次。圖譜之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.990 3、0.991 4、0.993 5、0.990 5、0.989 9,RSD為0.31%，說明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實驗

取2號樣品壓片放入干燥器中保存，每隔2 h測試1次，共測定5次。圖譜之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.990 2、0.989 1、0.990 6、0.991 2、0.988 9，RSD為0.58%,表明樣品在10 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性實驗

取2號樣品粉末5份進(jìn)行測試。圖譜之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.988 7、0.991 1、0.991 6、0.990 8、0.989 2，RSD為0.47%,表明測定方法符合重復(fù)性要求。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 紅外光譜指紋圖譜測定分析

對1～20號藥材樣品進(jìn)行紅外光譜測定，結(jié)果見圖1。

圖1 20批次遼東楤木葉提取物紅外光譜圖

遼東楤木葉藥材中所含化學(xué)成分主要有皂苷類、黃酮類、糖類化合物，除此以外，還有脂肪類、揮發(fā)油類、氨基酸以及蛋白質(zhì)類。從圖1可見， 20個產(chǎn)地遼東楤木葉藥材中，4、5、8、9、15號藥材的紅外光譜在532、1 045、1 076、1 161、1 261、1 392、1 408、1 458、1 604、2 854、2 924、3 367波數(shù)(cm-1)附近有明顯的吸收峰；其余的藥材紅外光譜在528、586、636、895、1 037、1 076、1 161、1 207、1 261、1 307、1 377/1 385、1 454、1 512、1 601、1 654(8月份的有，7、9月份的不全)、1 721、2 878、2 928、3 383波數(shù)(cm-1)附近都有吸收峰。5、9、15號為5月份藥材，4、8號為6月份藥材。在相同條件下測得不同批次的遼東楤木葉藥材提取物的紅外特征吸收峰中，8月份最多，5、6月份少。

3.2 紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)分析

紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)能有效提高紅外譜圖的分辨率，消除譜圖的背景和基線的影響，擴(kuò)大譜圖間的差異，因此導(dǎo)數(shù)譜是紅外光譜分析中的有效工具。圖2 是20批樣品紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)全圖。從圖中可以看出，5、9、15號圖譜峰數(shù)量偏少，說明不具備某些官能團(tuán)成分；且出現(xiàn)的峰強(qiáng)度均偏弱，說明某些成分含量偏低，這幾個樣品屬于5月份的樣品。其他樣品二階導(dǎo)數(shù)圖譜峰數(shù)量差別不大，但峰強(qiáng)度有一定的差別，4、8、14號屬于6月份樣品，在1 800～1 400 cm-1指紋區(qū)里峰強(qiáng)度低于同一地區(qū)7、8、9月份的峰強(qiáng)度，說明6月份某些成分含量較低。其他樣品基本都來源于7、8、9月份，譜峰數(shù)量及強(qiáng)度差別不明顯。

圖2 遼東楤木葉紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖譜

3.3 紅外光譜指紋圖譜共有模式建立

運(yùn)用平均值法建立紅外指紋圖譜共有模式，以此作為遼東楤木葉藥材的紅外光譜指紋圖譜。對于紅外指紋圖譜共有峰的確定方法是：一組吸收峰，若組內(nèi)吸收峰的波數(shù)最大差異顯著小于其與相鄰組之間的平均波數(shù)差，這組峰就應(yīng)是一組共有峰。20個測試樣品中，去掉5、9、15號屬于5月份的樣品，分析剩余17個樣品的紅外光譜峰，其共有模式及共有峰見圖3。

3 379cm-1附近強(qiáng)寬峰吸收峰，為-O-H或-N-H的伸縮振動峰υ(O-H)、υ(N-H)，2 932 cm-1和2 878 cm-1附近尖吸收峰，為-C-H伸縮振動峰υ(C-H)，其中峰型不同，表明-CH3和-CH2-含量不同，1 720 cm-1附近為羰基-C=O伸縮振動峰υ(C=O)，1 654 cm-1、1 605 cm-1附近為-C=C-伸縮振動峰υ(C=C)，1 377 cm-1附近為-C-O-伸縮振動峰υ(C-O)，1 076及1 377 cm-1附近為苷類、萜類、多糖等碳水化合物C-O彎曲振動峰δ(C-O)。這些均為糖類、氨基酸類分子的特征吸收峰[5]。

圖3 遼東楤木葉提取物紅外光譜指紋圖譜及共有峰

3.4 相似度分析

對20個樣品的紅外光譜進(jìn)行了相似度分析，結(jié)果見表2。從表2可以看出，不同批次遼東楤木葉藥材的紅外光譜相似度相差較大，相似度數(shù)值在0.209～0.990之間，說明不同批次遼東楤木葉藥材紅外吸收表現(xiàn)出一定的差異性。特別是4、5、8、9、14、15號樣品與其他樣品相似度差別大，這些樣品分別來自不同地區(qū)5、6月份。來自不同地區(qū)的7、8、9月份樣品相似度差別不大，幾乎都在0.70以上。

3.5 聚類分析

采用SPSS19.0軟件對紅外光譜進(jìn)行比對，在400～4 000 cm-1選取吸光度值作為吸光度矩陣，用組間聯(lián)接聚類法對20個遼東楤木葉樣品進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果見圖4。由圖可知，5、9、15號聚為一類，為5月份藥材，其他為一類?？梢?月份遼東楤木葉與其他月份比較不屬于同一類，原因是其官能團(tuán)峰少，而且含量極低。其他不同地區(qū)不同采收期的遼東楤木葉歸為一類，說明其共性官能團(tuán)峰相近。

表2 不同批次遼東楤木葉藥材樣品紅外指紋圖譜相似度

圖4 遼東楤木葉紅外光譜聚類分析圖

4 結(jié)論

20批不同產(chǎn)地、不同采收期的遼東楤木藥材紅外光譜及其二階導(dǎo)數(shù)給出的信息是5月份樣品譜峰數(shù)目少，且譜峰強(qiáng)度低，說明5月份藥材某些特征官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)成分還沒有形成。6、7、8、9月份的樣品，樣品成分幾乎都含有共同的特征結(jié)構(gòu)，但6月份的峰強(qiáng)度低。說明骨架成分在6月份已經(jīng)形成，但是含量低。7、8、9月份采收的遼東楤木葉藥材成分結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、且含量差別小。同一時期不同產(chǎn)地的遼東楤木葉藥材的紅外圖譜無明顯差別。指紋圖譜分析結(jié)果表明我國東北地區(qū)遼東楤木葉50%乙醇、正丁醇萃取物在3 383、2 928、2 878、1 721、1 601、1 454、1 377/1 385、1 307、1 261、1 207、1 161、1 076、1 037、895、636、586、528 cm-1附近都有穩(wěn)定吸收峰。因此確定紅外指紋圖譜能夠在一定程度上評價遼東楤木葉藥材的質(zhì)量。7、8、9月份遼東楤木葉供試品的紅外指紋圖譜相似度大，且聚為一類，均能達(dá)到IR指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)。因此，從紅外指紋圖譜及相關(guān)分析可初步確定，東北不同地區(qū)采收于7、8、9月份的遼東楤木葉均符合藥用標(biāo)準(zhǔn)。