基于miR-33a調(diào)控ABCA1表達(dá)探討血管軟化丸抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

秦合偉，李彥杰，任錕，張志鑫，邢若星，盧永保

(河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)，河南 鄭州 450002)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心腦血管疾病最主要的病理改變基礎(chǔ)，目前認(rèn)為與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)紊亂、免疫應(yīng)答和與其相關(guān)的慢性炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。AS發(fā)病機(jī)制和病理的復(fù)雜性給臨床的治療和預(yù)防帶來(lái)一定的困難。MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNA，通過(guò)與靶標(biāo)基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)靶向結(jié)合而降解靶基因的mRNA，或靶向結(jié)合后抑制蛋白質(zhì)翻譯，最終達(dá)到調(diào)控基因的表達(dá)的目的。miR-33a位于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(SREBP-2)基因的第16位內(nèi)含子中，在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)具有高度保守性，miR-33a的主要靶基因是三磷酸腺苷結(jié)合盒A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)，ABCA1是介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇流出的主要膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，既往有研究表明，miR-33a通過(guò)抑制ABCA1的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成[1-3]。本課題組既往研究表明，血管軟化丸具有調(diào)節(jié)血脂，抗炎，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本課題旨在研究血管軟化丸調(diào)節(jié)血脂抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用是否與調(diào)控miR-33a，影響ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物

單核巨噬細(xì)胞(THP-1細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心)；C57BL/6J小鼠(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)，其中12只作為正常組；ApoE-/-小鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2010-0001),共48只，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量(18±2)g，雄性；SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003),20只，雄性，體質(zhì)量(300±20)g。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 藥物與試劑

血管軟化丸，組方：山楂30 g，神曲30 g，萊菔子15 g，陳皮12 g，清半夏9 g，茯苓15 g，連翹12 g，郁金12 g，枸杞子15 g，三七12 g，珍珠30 g，代赭石30 g。所用中藥均來(lái)源于河南省中醫(yī)院藥劑科，通過(guò)醫(yī)院煎藥房煎煮和濃縮成不同濃度的湯劑(血管軟化丸高劑量：濃度為3.456 g/mL；血管軟化丸中劑量：濃度為1.728 g/mL；血管軟化丸低劑量：濃度為0.864 g/mL)。

miR-33a模擬物(miR-33a mimic)購(gòu)自廣州銳博公司；ABCA1兔抗人一抗以及佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購(gòu)自Sigma 公司；GAPDH 和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自杭州賢致公司；總RNA抽提試劑盒、總RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ABCA1蛋白定量試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas；蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；oxLDL購(gòu)自廣州瑞博生物科技有限公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 血管軟化丸含藥血清的制備

血清的制備所用SD大鼠40只分為4組，即空白組和血管軟化丸的高、中、低3個(gè)不同劑量組。空白組給予蒸餾水灌胃，血管軟化丸3個(gè)劑量組分別給予不同濃度的血管軟化丸(高劑量：濃度為3.456 g/mL；中劑量：濃度為1.728 g/mL；低劑量：濃度為0.864 g/mL)灌胃，制取空白、高、中、低4個(gè)濃度的含藥血清，連續(xù)灌胃1周。1周后，腹主動(dòng)脈取血，12 000 g/min高速離心，取上清液，56℃滅活，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

THP-1細(xì)胞加入160 nmol/LPMA培養(yǎng)24 h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞后用50 mg/L 的oxLDL孵育，使巨噬細(xì)胞變成泡沫細(xì)胞，作為本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀HP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分為空白組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。加處理因素：高、中、低3個(gè)濃度的含藥血清。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 造模與給藥

所有小鼠自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，ApoE-/-小鼠給予高脂飼料(含脂肪21%、膽固醇0.15%)；各組均予以自由飲水。C57BL/6J小鼠12只作為正常組，給予高脂飼料飼養(yǎng)4周后將48只ApoE-/-小鼠按照隨機(jī)數(shù)表法平均分為4組，空白組對(duì)照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。對(duì)照組給予生理鹽水灌胃；中藥組分別給予血管軟化丸(高劑量：濃度為3.456 g/mL；中劑量：濃度為1.728 g/mL；低劑量：濃度為0.864 g/mL)灌胃。

1.5.2 樣品采集與處理

所有要取材動(dòng)物禁食12 h，采用眼眶取血法采血，按摩心臟部位，用離心管收集血液，低速離心，分離血清，冷凍保存。采血結(jié)束后脫頸椎處死，剖腹，分離主動(dòng)脈(主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈)，用10%多聚甲醛固定主動(dòng)脈6 h，主動(dòng)脈經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋后切片。

1.5.3 病理學(xué)切片觀察

主動(dòng)脈經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋后切片，厚度設(shè)定為4 μm，采用常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色法進(jìn)行切片染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5.4 miR-33a、ABCAl基因表達(dá)水平的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈miR-33a、ABCA1基因表達(dá)水平。將小鼠主動(dòng)脈組織稱取質(zhì)量后，加入適量的TRIZOL，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。方法同上。采用比較CT值法對(duì)樣品擴(kuò)增的CT值進(jìn)行計(jì)算，再按照以下方法計(jì)算出各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量：△CT=目的基因CT-內(nèi)參CT；△△CT=觀察樣本△CT-對(duì)照樣本△CT；樣本的相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT，引物序列見(jiàn)表1。

1.5.5 ABCA1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot技術(shù)，檢測(cè)各組小鼠主動(dòng)脈ABCA1蛋白表達(dá)水平。取小鼠主動(dòng)脈，用PBS沖洗3次，洗去殘血，磨碎勻漿后加入蛋白裂解液裂解蛋白，于4℃，1 000×g離心10 min，小心吸取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。采用G250-Bradford蛋白濃度測(cè)定法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。觀察ABCA1蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，以β-actin蛋白為內(nèi)參，目的蛋白表達(dá)條帶密度與β-actin條帶密度的比值即為相對(duì)表達(dá)量[4-5]。

1.6 體外實(shí)驗(yàn)

1.6.1 Real-Time PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞miR-33a表達(dá)

用空白血清和高、中、低三個(gè)濃度的含藥血清處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h，或用高劑量組含藥血清處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12、24 h)，提取細(xì)胞RNA。miR-33a上游引物為： 5-GUUGUUGCUAGUUGCGUUG-3′，下游引物為： 5-GUGUGUAGUUGUUGCAUUG-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)，設(shè)U6 為內(nèi)參，其相對(duì)表達(dá)量采用△△CT法計(jì)算。

1.6.2 Real-Time PCR和Werstern blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ABCA1表達(dá)

空白血清組和含藥血清組(高濃度含藥血清采用高劑量血管軟化丸3.456 g/mL灌胃取血清)，聯(lián)合處理組(高濃度含藥血清+ miR-33a mimic濃度80 nmol/L)。采用含藥血清處理后檢測(cè)，Real-Time PCR檢測(cè)方法同上。Werstern blot檢測(cè)方法：用各組血清處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，用蛋白裂解液裂解總蛋白，提取蛋白，經(jīng)定量后，加入緩沖液，加熱使蛋白質(zhì)變性，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉，加入相應(yīng)濃度的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次。加入二抗，室溫孵育，TBST洗滌3次。用堿磷酶化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯色。使用ImageJ的軟件分析條帶灰度值[5]。

1.6.3 油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量

將細(xì)胞接種于48孔板，誘導(dǎo)分化和BPA處理，隔日應(yīng)用PBS液洗滌3次，采用4%多聚甲醛固定10 min后吸棄培養(yǎng)液，加入固定液；PBS液洗滌3次，加入染色液15 min后，用蘇木精染色5 min，10 mL/L HCl 分色，水沖洗至變藍(lán)，雙蒸水沖洗后甘油明膠封片。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅染，細(xì)胞核呈藍(lán)染，顯微鏡拍照。

1.6.4 高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量

參照文獻(xiàn)方法[3]，收集細(xì)胞，加入生理鹽水200 μL，冰浴中超聲破碎細(xì)胞，用BCA 法測(cè)定蛋白含量后，加入三氯乙酸(6%)沉淀并去除蛋白，取上清進(jìn)行膽固醇檢測(cè)。取100 μL上清液，加入氫氧化鉀溶液(8.9 mol/ L) 200 μL，水解膽固醇酯后作為細(xì)胞內(nèi)總膽固醇待測(cè)樣品。將樣品分別與內(nèi)標(biāo)液(豆甾醇)混勻，再用正己烷：異丙醇(3：2，V/V)溶液和無(wú)水乙醇抽提后真空干燥。上樣前用100 μL乙晴-異丙醇(70：30，V/V) 溶解樣品，采用C-18柱，溫度為室溫，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，以峰面積定量膽固醇，內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，以mg/g細(xì)胞蛋白為單位。

1.6.5 [3H]法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出

細(xì)胞先在正常培養(yǎng)液中和7.4 μGBq×103/L[3H]膽固醇共同孵育24 h，用PBS液洗滌細(xì)胞后置含脂蛋白的無(wú)血清培養(yǎng)液中再培養(yǎng)24 h。PBS液漂洗細(xì)胞3次，加入閃爍液裂解細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)法檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞中的[3H]膽固醇含量。

膽固醇的流出率(%)=培養(yǎng)液中cpm+總cpm(培養(yǎng)液cpm+細(xì)胞cpm)×100%[3]

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 一般情況

飼養(yǎng)和灌胃過(guò)程中C57BL/6/J小鼠死亡4只(因相互撕咬導(dǎo)致死亡2只，灌胃操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡2只)，ApoE-/-小鼠死亡3只(因相互撕咬導(dǎo)致死亡1只，灌胃操作不當(dāng)導(dǎo)致死亡2只)，剔除離群值，最后進(jìn)入統(tǒng)計(jì)的各組小鼠數(shù)量各為10只。

2.1.2 各組小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)觀察

在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，正常組：小鼠主動(dòng)脈壁厚薄均勻，主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平整，內(nèi)膜各層結(jié)構(gòu)正常，未發(fā)現(xiàn)明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病灶?？瞻讓?duì)照組：光鏡下可見(jiàn)動(dòng)脈管腔不平，管腔內(nèi)膜顯著增厚；管壁厚度、斑塊截面積顯著大于正常組。中藥三個(gè)劑量組：主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)正常，局部可見(jiàn)小灶性的鈣化顆粒物沉積，可見(jiàn)較小斑塊，病變程度明顯較輕。結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：1.正常組；2.空白對(duì)照組；3.高劑量組；4.中劑量組；5.低劑量組。圖1 各組小鼠主動(dòng)脈病理學(xué)改變(光學(xué)顯微鏡，200×)

2.1.3 血管軟化丸對(duì)小鼠主動(dòng)脈主動(dòng)脈miR-33a、ABCA1基因和蛋白表達(dá)水平的影響

藥物干預(yù)后，血管軟化丸高、中、低三個(gè)劑量組小鼠主動(dòng)脈的miR-33a表達(dá)量較空白對(duì)照組降低、ABCA1基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明,隨著對(duì)miR-33a的抑制，ABCA1水平逐漸上升。結(jié)果見(jiàn)表2，圖2。

表2 血管軟化丸對(duì)小鼠主動(dòng)脈主動(dòng)脈miR-33a、ABCA1基因和蛋白表達(dá)水平的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，△P<0.05。

圖2 各組小鼠主動(dòng)脈ABCA1蛋白表達(dá)

2.2 血管軟化丸含藥血清對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞毒性的觀察

分別用空白、高、中、低4個(gè)濃度的血管軟化丸含藥血清處理THP-1巨噬細(xì)胞24 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，與空白血清處理組相比，高、中、低4個(gè)濃度的血管軟化丸含藥血清處理組細(xì)胞活力無(wú)明顯差異(P>0.05)，結(jié)果表明高濃度的血管軟化丸含藥血清對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性。見(jiàn)圖3。

圖3 血管軟化丸含藥血清對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞毒性的觀察

2.3 血管軟化丸含藥血清對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞miR-33a表達(dá)的影響

分別用空白、高、中、低4個(gè)濃度的血管軟化丸含藥血清處理THP-1巨噬細(xì)胞24 h。Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，高、中、低4個(gè)濃度的血管軟化丸含藥血清后，細(xì)胞中miR-33a表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，高濃度的血管軟化丸含藥血清處理組下調(diào)最為明顯,見(jiàn)圖4。隨后，用高濃度的血管軟化丸含藥血清處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時(shí)間，Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，處理12 h組細(xì)胞miR-33a 表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，處理24 h 組細(xì)胞miR-33a表達(dá)下調(diào)更為明顯,見(jiàn)圖5。

注：與空白照組比較，*P<0.05。圖4 不同濃度含藥血清對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞miR-33a表達(dá)的影響

注：與空白照組比較，*P<0.05。圖5 高濃度含藥血清處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞在不同時(shí)間對(duì)miR-33a表達(dá)的影響

2.4 各組THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平

高、中、低濃度血管軟化丸含藥血清處理后，高濃度的血管軟化丸含藥血清對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞miR-33a表達(dá)下調(diào)最為明顯，故采用高濃度的血管軟化丸含藥血清處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，觀察其對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平的影響。

細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、含藥血清處理組、含藥血清+80 nmol/L miR-33a mimic聯(lián)合處理組，處理24 h后，分別提取細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)，采用Real-Time PCR以及Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，含藥血清組細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白均明顯上調(diào)(P<0. 05)；而聯(lián)合處理組與含藥血清單獨(dú)處理組相比，細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)均明顯下調(diào)(P<0. 05)，見(jiàn)表3，圖6。提示，當(dāng)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞miR-33a過(guò)表達(dá)后，EGCG上調(diào)細(xì)胞ABCA1表達(dá)的作用被明顯抑制。

表3 各組THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)水平

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.05；與含藥血清組比較，▲P<0.05。

圖6 各組THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白表達(dá)水平

2.5 miR-33a在血管軟化丸含藥血清減少THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用

油紅O結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，含藥血清單獨(dú)處理組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯減少，而加入80 nmol/L miR-33a mimic共同處理后，細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴又明顯增多，見(jiàn)圖7。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，含藥血清處理組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯均明顯減少；而聯(lián)合處理組與含藥血清處理組相比，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯的含量則明顯增加，見(jiàn)表4。

表4 miR-33a在含藥血清減少THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.05；與含藥血清組比較，▲P<0.05。

注：A.空白對(duì)照組；B.含藥血清組；C.聯(lián)合處理組。圖7 miR-33a在血管軟化丸含藥血清減少THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用(200×)

2.6 miR-33a在血管軟化丸含藥血清促THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫膽固醇流出中的作用

與空白對(duì)照組相比，含藥血清處理使細(xì)胞膽固醇流出明顯增加(P<0. 05)。而加入80 nmol/L miR-33a mimic共同處理細(xì)胞后，血管軟化丸含藥血清促膽固醇流出作用被明顯抑制(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.05；與含藥血清組比較，▲P<0.05。圖8 miR-33a在含藥血清促THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫膽固醇流出中的作用

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化作為心腦血管疾病最常見(jiàn)和最基本的病理改變，是一個(gè)長(zhǎng)期綜合性的病理過(guò)程，動(dòng)脈粥樣硬化病理機(jī)制尚未十分明確，一般認(rèn)為與患者脂代謝異常、高血壓、糖尿病和吸煙等因素有關(guān)，關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，有脂質(zhì)侵潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說(shuō)、炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)、免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和肥大細(xì)胞等)浸潤(rùn)、LDL受體缺失學(xué)說(shuō)、損傷應(yīng)答學(xué)說(shuō)、剪切應(yīng)力學(xué)說(shuō)等。

目前，MicroRNAs在脂質(zhì)代謝中的調(diào)節(jié)作用日益得到重視，MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNA，其介導(dǎo)的基因表達(dá)是機(jī)體內(nèi)一個(gè)廣泛存在的基因表達(dá)調(diào)控方式，miRNA通過(guò)與靶標(biāo)基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)靶向結(jié)合而降解靶基因的mRNA，或靶向結(jié)合后抑制蛋白質(zhì)翻譯，最終達(dá)到調(diào)控基因的表達(dá)的目的。研究顯示，miRNA在心血管系統(tǒng)中高度表達(dá)，尤其在AS中起重要的作用[6]。研究表明，參與AS脂質(zhì)代謝的miRNA，包括miR-122、miR-370、miR-378/378、miR-335、miR-27、miR-125a-5p和miR-33等[7]，靶基因包括ABCA1、NPC1、ABCG1、SREBP 和PPARγ等[8]。其中miRNA33通過(guò)調(diào)控ABCA1表達(dá)，影響膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。研究表明，在膽固醇平衡的調(diào)節(jié)中，miR-33通過(guò)靶向ABCA1、ABCG1和NPC1發(fā)揮作用[9-11]。在人體中存在兩種miR-33基因，miR-33b位于第17號(hào)染色體SREBP-1基因的17號(hào)內(nèi)含子區(qū)域，其宿主基因可選擇性調(diào)控脂肪酸和三酰甘油的合成；miR-33a是位于SREBP-2基因的第16位內(nèi)含子中，其宿主基因控制著細(xì)胞內(nèi)的膽固醇合成和攝取，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守，其主要靶基因是ABCA1，ABCA1是介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇流出的主要膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，研究表明，miR-33a可抑制ABCA1表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成[3]。隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的研究日漸廣泛和深入，中醫(yī)藥的療效和優(yōu)勢(shì)逐漸受到重視，學(xué)術(shù)界將熱點(diǎn)指向如何綜合揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展演變及中藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的具體作用機(jī)制。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大多數(shù)慢性病患病日久，往往逐漸出現(xiàn)血瘀之癥，即“久病必瘀”，其“瘀”，可以為血瘀亦可為痰瘀互結(jié)[12]。追其源流，古人早有論述。《素問(wèn)痹論》指出：“病久入深，營(yíng)衛(wèi)行澀，經(jīng)絡(luò)失疏故不同”。朱丹溪曰:“久病必瘀”，葉天士曰：“大凡經(jīng)主氣，以絡(luò)主血，久病血瘀”。當(dāng)今社會(huì)，民食多以甘美，待客多飲酒釀，嗜煙草者眾，“飲食自倍，脾胃乃傷”，加之勞心思慮，郁怒在所難免，因此，病多虛中挾實(shí)，治病不宜純補(bǔ)，宜“寓補(bǔ)于消，以消代補(bǔ)”，消者去其雍也。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床研究，我們認(rèn)為痰瘀阻滯是動(dòng)脈粥樣硬化的主要證型，李鯉教授創(chuàng)立“血管軟化丸”即有此意。血管軟化丸由山楂、神曲、萊菔子、陳皮、清半夏、茯苓、連翹、郁金、枸杞子、三七、珍珠、代赭石等12味中藥組成[13-14]。方中山楂消食導(dǎo)滯為君藥；神曲消食健胃祛除酒食陳腐之積；萊菔子長(zhǎng)于下氣除脹，消食除積；半夏和茯苓健脾除濕化痰；郁金和三七解郁行氣，化瘀散結(jié)；枸杞子滋補(bǔ)肝腎以固本；珍珠和代赭石平肝潛陽(yáng)，降逆祛痰，共為臣藥；陳皮理氣和中為佐藥；甘草調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，共奏消積化痰，活血化瘀，平肝潛陽(yáng)之功。

本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察血管軟化丸是否通過(guò)調(diào)控miR-33a，進(jìn)而影響ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，從分子、細(xì)胞、組織以及動(dòng)物水平等多層次揭示中藥復(fù)方血管軟化丸防治AS的分子機(jī)制，為AS相關(guān)疾病的防治提供新思路。研究結(jié)果顯示,在不影響細(xì)胞活性狀況下，血管軟化丸含藥血清呈濃度和時(shí)間依賴性下調(diào)miRNA33a表達(dá)；血管軟化丸含藥血清能明顯上調(diào)ABCA1 mRNA和蛋白的表達(dá)，但能被轉(zhuǎn)染miRNA33mimic抑制；血管軟化丸含藥血清可減少THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)蓄積，但能被細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA33 mimic所弱化；EGCG減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積是與其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出有關(guān)，細(xì)胞中轉(zhuǎn)入過(guò)量miRNA33a可以抑制膽固醇流出。病理觀察發(fā)現(xiàn),各中藥組血管各層結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，局部有小灶性的鈣化顆粒物沉積，病變輕，斑塊小，泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)減少，彈力板基本完整，病變程度明顯輕于空白對(duì)照組。與空白對(duì)照組相比，血管軟化丸高、中、低3個(gè)劑量組小鼠主動(dòng)脈的miR-33a表達(dá)量降低、ABCA1基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高。以上研究結(jié)果表明，血管軟化丸可通過(guò)減少miR-33a的生成，進(jìn)而上調(diào)ABCA1表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇流出，這可能是血管軟化丸抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的分子機(jī)制之一。