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    胱硫醚β-合成酶基因844ins68多態(tài)性與新疆漢族乳腺癌的相關(guān)性研究

    2018-11-12 06:58:52莫少華劉新權(quán)徐春玲張偉程江曹玉文張蕾
    關(guān)鍵詞:漢族多態(tài)性基因型

    莫少華 ,劉新權(quán) ,徐春玲 ,張偉 ,程江 ,曹玉文 ,張蕾 *

    (1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2第五師醫(yī)院,新疆 博樂 833400;3石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832000)

    乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率分別占全世界的12.2%和9.6%[1]。乳腺癌病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,由于腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出的與正常生長(zhǎng)的細(xì)胞不同的代謝特征,使得腫瘤代謝途徑引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。目前手術(shù)治療是乳腺癌的主要治療方式,術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響患者生存率和死亡率的主要因素,因此,研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制,探索乳腺癌治療的新手段是減少患者死亡率的重要途徑。

    研究顯示,胱硫醚β-合成酶 (cystathione β synthase,CBS)基因突變可能對(duì)腫瘤發(fā)生具有潛在的影響[2]。CBS基因第8外顯子844位存在68bp的插入突變,該基因發(fā)生D到I的突變,產(chǎn)生三種基因型:野生DD型、雜合突變DI型、純合突變II型,使酶蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致酶活性改變,引發(fā)體內(nèi)生物學(xué)功能發(fā)生改變[3]。CBS844ins68突變與乳腺癌的關(guān)系結(jié)論不一,且存在種族、地域差別。本次研究運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)CBS844ins68基因多態(tài)性,分析CBS844ins68基因多態(tài)性與新疆漢族乳腺癌是否相關(guān)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    (1)乳腺癌組:選取2016年9月至2017年12月新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和第五師醫(yī)院住院治療的乳腺癌女性患者150例,中位數(shù)年齡52歲,納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前均未行針對(duì)乳腺癌的放射和化學(xué)治療,術(shù)后均經(jīng)病理確診。納入標(biāo)準(zhǔn)符合最新WHO乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):未經(jīng)手術(shù)治療的乳腺癌患者;同時(shí)患兩種以上惡性腫瘤患者;既往腫瘤史患者;有乳腺癌家族史的乳腺癌患者。(2)對(duì)照組:隨機(jī)抽取同期來我院的健康女性體檢者150例,中位數(shù)年齡53歲,納入標(biāo)準(zhǔn):無乳腺癌家族史及其他腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn):有乳腺癌家族史及其他腫瘤病史,與同期收集的病例組有生物學(xué)關(guān)聯(lián)。所有研究對(duì)象均在本地居住5年以上。

    1.2 研究方法

    1.2.1 樣本采集

    采集兩組研究對(duì)象外周靜脈抗凝全血6 mL,其中一管EDTAK2抗凝3 mL,用于血液基因組DNA提取,凍存于-80℃。另一管肝素抗凝3 mL,3000 r/min離心10 min,分離血漿檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。

    1.2.2 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物

    AFP、CEA、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4 檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行,運(yùn)用羅氏601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。

    1.2.3 血液基因組DNA提取

    外周靜脈抗凝全血3 mL,按照北京天根生化科技有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒DP304-02(離心柱型)說明提取基因組DNA,測(cè)量樣本DNA在分光光度計(jì)260 nm和280 nm處的光密度(D)值,以評(píng)估所提取DNA純度和濃度并用0.7%瓊脂糖凝膠電泳判定DNA的質(zhì)量。DNA凍存于-80℃。

    1.2.4 引物合成

    引物序列參考有關(guān)文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì),由上海生工生物有限公司合成。序列為P1:5’-CTGGCCTTGAGCCCTGAA-3’,P2:5’-GGCCGGGCTCTGGACTC-3’。

    1.2.5 PCR擴(kuò)增及電泳判斷基因型

    PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中DNA模板2.0 μL,上下游引物各 1.0 μL,PCR MasterMix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR引物及反應(yīng)條件為95℃變性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,36個(gè)循環(huán),72℃再延伸5 min,PCR反應(yīng)完成后,取PCR產(chǎn)物 5 μL,在 2%瓊脂糖凝膠中,110V,電泳50min,美國(guó)伯樂公司Bio-RAD凝膠成像儀成像,檢測(cè)分析基因型。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn);P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CBS844ins68基因型及其他危險(xiǎn)因素與乳腺癌的相關(guān)性用Logistic回歸分析,結(jié)果以相對(duì)危險(xiǎn)度(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)表示。

    2 結(jié)果

    2.1 新疆漢族乳腺癌組和對(duì)照組的一般臨床資料分析

    兩組僅是否絕經(jīng)、CEA、CA15-3的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)(表 1)。

    表1 乳腺癌組和對(duì)照組的一般臨床資料分析 n/%Tab.1 General clinical data analysis of breast cancer and control groups n/%

    2.2 PCR及基因型鑒定結(jié)果

    CBS844ins68位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段長(zhǎng)度為184 bp,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳得到兩種基因型:野生型(DD型),可見184 bp一個(gè)條帶;雜合突變型(DI型),可見184bp和252 bp兩個(gè)條帶;純合子突變型(II型)未檢測(cè)到(圖 1)。

    圖1 CBS844ins68擴(kuò)增圖Fig.1 CBS844ins68 amplification

    2.3 CBS844ins68基因多態(tài)性在乳腺癌組和對(duì)照組的分布情況

    CBS844ins68基因多態(tài)性在乳腺癌組和對(duì)照組的分布情況由表2可知:

    表2 乳腺癌組與對(duì)照組CBS844ins68基因型及等位基因分布情況 n/%Tab.2 CBS844ins68 genotype and allele frequency distribution in breast cancer and control groups n/%

    乳腺癌組CBS844ins68基因型DD、DI、II分別為94.0%、6.0%、0;對(duì)照組 CBS844ins68基因型 DD、DI、II分別為 96.7%、3.3%、0[l8]。乳腺癌組 CBS844 ins68等位基因D、I頻率分別為97.0%、3.0%;對(duì)照組CBS844ins68等位基因 D、I頻率分別為 98.3%、1.7%[19],兩組基因型與等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

    2.4 CBS844ins68基因多態(tài)性與乳腺癌的多因素分析

    以乳腺癌的發(fā)生(對(duì)照=0,乳腺癌=1)作為因變量,以 CBS844ins68多態(tài)性(DD=1,DI=2)、年齡(≥50=0,<50=1)、絕經(jīng)(未絕經(jīng) =1,絕經(jīng) =2)、AFP(<7=0,≥7=1)、CEA (<3.4=0,≥3.4=1)、CA125(<35=0,≥35=1)、CA15-3(<25=0,≥25=1)、CA19-9(<27=0,≥27=1)、CA72-4(<6.9=0,≥6.9=1) 為自變量,采用二分類 Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析,結(jié)果顯示年齡<50歲、已絕經(jīng)、AFP≥7.0、CA15-3≥25、CEA≥3.4可增加新疆漢族乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)3-9倍(表 3)。

    表3 乳腺癌危險(xiǎn)因素的 Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of breast cancer risk factors

    3 討論

    乳腺癌是復(fù)雜的贅生物和腫瘤細(xì)胞集合,由來自不同亞型的細(xì)胞群組成,在臨床表現(xiàn)、病理分型、免疫組化、腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平及預(yù)后呈現(xiàn)多樣性表達(dá)。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究的飛速發(fā)展,乳腺癌的遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制研究在持續(xù)深入,流行病學(xué)研究顯示[5],遺傳因素和環(huán)境因素在乳腺癌發(fā)病過程中呈現(xiàn)出獨(dú)特影響作用。基因改變是環(huán)境致癌因子致癌作用的一個(gè)重要過程。人群中不同的CBS基因型有可能決定不同個(gè)體間CBS的表達(dá)與功能上的差異,進(jìn)而影響到體內(nèi)CBS的最終生物學(xué)效應(yīng)[6]。關(guān)于CBS基因多態(tài)性的研究較多,但尚無統(tǒng)一結(jié)論。目前CBS844ins68基因多態(tài)性與新疆乳腺癌相關(guān)性研究尚未證實(shí),本研究選取新疆漢族乳腺癌人群為研究對(duì)象,首次探討CBS844ins68多態(tài)性與乳腺癌之間的相關(guān)性。

    CBS位于染色體 21q22.3,長(zhǎng) 25~30KB,編碼 551個(gè)氨基酸。CBS基因中的突變位點(diǎn)有80多個(gè),多數(shù)分布在第3和第8外顯子中,常見突變位點(diǎn)有844ins68、T833C等。CBS844ins68存在野生型(DD)、雜合突變型(DI)、純合突變型(II)3種基因型。DD型是CBS基因第8外顯子的844位點(diǎn)沒有插入68個(gè)核苷酸;DI型是一個(gè)染色體插入68個(gè)核苷酸,另一個(gè)染色體沒有插入68個(gè)核苷酸;II型是兩個(gè)染色體都插入了68個(gè)核苷酸,這種變化是一種基因重排引起的插入突變。由于CBS844插入產(chǎn)生提前出現(xiàn)的終止密碼子,導(dǎo)致產(chǎn)生縮短的蛋白質(zhì)及無功能的CBS酶。該基因發(fā)生突變后,其編碼的異亮氨酸取代天冬氨酸,引起CBS代謝酶活性降低。研究顯示,不同地區(qū)不同種族CBS844ins68基因型和基因頻率差異很大。鐘慧軍[7]發(fā)現(xiàn)廣西寧夏漢族基因型為DD 70.21%、DI 19.86%、II 9.93%,朱文麗[8]研究北京地區(qū)人群發(fā)現(xiàn)基因型為DD 87.4%、DI 12.6%,陳作森[9]報(bào)道山東濰坊漢族人群基因型為DD 99.32%、DI 0.68%,史嘉翊[10]研究黑龍江牡丹江地區(qū)409例朝鮮族和漢族人群發(fā)現(xiàn)均為DD基因型。Gallegos[11]對(duì)墨西哥瓜達(dá)哈拉地區(qū)323名乳腺癌患者進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)CBS844ins68 DD和DI基因型突變影響墨西哥乳腺癌人群易感性。英國(guó)人群變異的DI基因型頻率為20%,哥倫比亞和智利人群DI基因型的頻率為10%[12]。人群中68BP插入的純合突變很少,在日本和印度尼西亞沒有觀察到CBS 844ins68等位基因突變體[13]。本研究結(jié)果顯示,新疆漢族乳腺癌組CBS844ins68位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分別為94.0%、6.0%、0和97.0%、3.0%;對(duì)照組基因型頻率和等位基因頻率分別為96.7%、3.3%、0和98.3%、1.7%,兩組基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明CBS基因CBS844ins68位點(diǎn)與新疆漢族乳腺癌發(fā)生無相關(guān)性。

    本次研究發(fā)現(xiàn)新疆漢族乳腺癌人群中年齡小于50歲、已絕經(jīng)、AFP、CEA、CA15-3水平增高是乳腺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。文獻(xiàn)報(bào)道,我國(guó)乳腺癌高發(fā)年齡為40~49歲,西方國(guó)家為50~59歲,本次研究發(fā)現(xiàn)小于50歲人群乳腺癌發(fā)病危險(xiǎn)性增高,與Bouchardy研究結(jié)果一致[14]。瞿蕾[15]發(fā)現(xiàn)是否絕經(jīng)與乳腺癌的發(fā)生具有相關(guān)性,絕經(jīng)晚是乳腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素,與本次研究結(jié)果有不一致之處,分析原因可能與納入人群不同、遺傳因素及不同地域人群飲食習(xí)慣和生活方式不同有關(guān)。張同成[16]檢測(cè)乳腺癌患者腫瘤標(biāo)志物水平發(fā)現(xiàn)AFP顯著增高,認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生引發(fā)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞激活A(yù)FP基因,AFP水平和腫瘤生物學(xué)特性、分化程度密切相關(guān)。Shao Y[17]研究顯示術(shù)前血清CEA和CA15-3水平是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,CEA和CA15-3明顯升高與腫瘤大小、晚期腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wu S G[18]回顧性地分析1148例乳腺癌患者術(shù)前的CEA和CA15-3水平,發(fā)現(xiàn)術(shù)前血清CEA和CA15-3水平升高的患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率更高,提示CEA和CA15-3可用于預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)后及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)新疆漢族乳腺癌的危險(xiǎn)因素為年齡小于50歲、已絕經(jīng)、AFP、CEA、CA15-3水平增高的人群,CBS844ins68基因多態(tài)性與新疆漢族乳腺癌發(fā)生無相關(guān)性。由于本研究樣本例數(shù)較少,實(shí)驗(yàn)納入人群有限,在以后工作和研究過程中會(huì)加大樣本數(shù),同時(shí)進(jìn)行多地區(qū)、多民族、多基因的實(shí)驗(yàn),為臨床上治療乳腺癌提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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