對蝦急性肝胰腺壞死綜合癥雙重PCR檢測方法的建立

鄧 艷 ， 黃燕瓊 ， 戴 金 ， 何淑華 ， 趙尚志 ， 柏建山

(廣州機場出入境檢驗檢疫局 ， 廣東廣州510470)

對蝦急性肝胰腺壞死綜合癥2009年最早在中國發(fā)生，2010年和2011年越南和馬來西亞先后報道了該病，此后，泰國、墨西哥，南美洲等國家和地區(qū)先后都有該病的報道[1-4]。該病病情發(fā)展十分迅速,而且死亡率極高。2013年初確認該病病原是一種特殊的副溶血弧菌，專業(yè)上稱為急性肝胰腺壞死綜合癥(Acute hepatopancreatic necrosis syndrome，AHPND)[5]。與非致病性的副溶血性弧菌相比較，AHPND攜帶了特殊質(zhì)粒的特異性副溶血弧菌，該質(zhì)粒上帶有與光桿菌同源的昆蟲相關毒素PriA和PriB的編碼基因[6]。本研究建立了可以同時檢測AHPND 的冷休克蛋白基因(CSP)和毒素基因的雙重PCR方法，并用此方法對2016-2017年廣州白云機場口岸進境的草蝦進行了監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器Taq酶套裝、TaKaRa MinBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KIT、MiniBEST Plasmid Purification Kit,購自寶生物工程(大連)有限公司，APW培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基、弧菌顯色培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；C1000 Touch PCR儀為Bio-rad公司產(chǎn)品；3K15高速離心機為Sigma公司產(chǎn)品； MULTISKAN GO全波長讀數(shù)儀為ThermoFisher公司產(chǎn)品。

1.2 樣品 2016年1月至2017年7月采集從廣州機場口岸進境的草蝦共118份，來源地為越南、泰國和馬來西亞等東南亞國家。

1.3 樣品處理 無菌采取對蝦的肝胰腺組織，3種方式處理后分別抽提DNA。第1種方式是直接用肝胰腺組織抽提DNA，第2種方式按照1∶10的比例將肝胰腺組織放入3%APW培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜，用培養(yǎng)液抽提DNA。第3種方式取第2部分的培養(yǎng)液劃TCBS平板和弧菌顯色平板， 37 ℃培養(yǎng)過夜。在TCBS平板上挑取2～3 mm，表面光滑的綠色單個菌落，弧菌顯色培養(yǎng)基上挑取品紅色單個菌落，37 ℃培養(yǎng)過夜后抽提菌液DNA。

1.4 PCR引物設計 根據(jù)質(zhì)粒pVPA3-1序列(NC_025252.1)設計兩對PCR引物。引物序列分別為：AB1：5′ TGACTATTCTCACGATTGGACTG 3′; AB2：5′ GCCATGTAAGTAATTTGAAGACT 3′；CSP1：5′TCGGTAAGATCAAAAACTACAAAGAC3′; CSP2：5′ CCTGACATTAACTTCCCATACTTGC 3′，產(chǎn)物長度分別為843 bp和666 bp。引物AB1和AB2擴增產(chǎn)物包括部分PriA和PriB基因，引物CSP1和CSP2擴增產(chǎn)物為部分CSP基因。

1.5 PCR反應體系和反應條件 PCR反應體系的最終體積為25 μL，其中10×PCR緩沖液2.5 μL，25 mmol/L的MgCl22.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L的引物AB1、AB2、CSP1、CSP2各1 μL，1 UTaqDNA聚合酶，模板2 μL，RNase-free 水補充至25 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，30個循環(huán)：94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃后延伸5 min。

1.6 引物濃度優(yōu)化 AB1、AB2和CSP1、CSP2引物濃度比分別采用1∶1，1∶1.5，1∶2，2∶1，1.5∶1，按照1.5的反應條件進行PCR反應。

1.7 PCR擴增靈敏度分析 將得到的陽性菌液抽提質(zhì)粒，全自動波長讀數(shù)儀測試質(zhì)粒的濃度。10倍梯度稀釋質(zhì)粒至10-6，用1.5的PCR反應體系和反應條件進行擴增。

1.8 樣品不同處理方式的比較 3種不同處理方式樣品用1.5的PCR反應條件和反應體系進行擴增。

2 結果

2.1 樣品檢測結果 從2016年1月至2017年6月共采集了118份對蝦樣品，通過雙重PCR檢測出6份ANHPD核酸陽性。

圖1 部分陽性樣品的PCR結果圖

1：空白對照； 2～7：陽性樣品； 8：DL-2 000 Marker； M： DL-2 000 Marker

2.2 引物濃度優(yōu)化結果 不同的AB1、AB2和CSP1、CSP2引物濃度都可以擴增出目標片段，AB1、AB2和CSP1、CSP2引物濃度比為2∶1,1.5∶1的時候產(chǎn)物電泳條帶弱，濃度比為1∶1的時候電泳條帶最強。

圖2 引物濃度結果分析圖

M： DL-2 000 Marker； 1：引物濃度比為1∶1； 2：引物濃度比1∶1.5；3： 引物濃度比1∶2； 4： 引物濃度比 2∶1； 5：引物濃度比1.5∶1

2.3 靈敏度分析結果 質(zhì)粒濃度為23 ng/μL，質(zhì)粒稀釋到10-2之后未見電泳條帶，因此10-2稀釋梯度是檢測的最低限。全自動波長讀數(shù)儀測試這時候質(zhì)粒的濃度為230 pg/μL。

圖3 靈敏度電泳圖

1： 未稀釋的質(zhì)粒； 2～7：10倍梯度稀釋的質(zhì)粒； 8：空白對照； M：DL-2 000 Marker

2.4 樣品不同處理方式的結果 肝胰腺直接抽提的DNA雙重PCR沒有擴增出條帶，菌液抽提DNA和肝胰腺培養(yǎng)液抽提DNA都能擴增出目標條帶。

圖4 樣品不同處理方式抽提DNA的電泳圖

M： DL-2 000 Marker； 1～6：肝胰腺培養(yǎng)液劃板后抽提菌落DNA； 7～12：樣品肝胰腺培養(yǎng)后抽提DNA

3 結論與討論

本研究采用3種處理方式進行抽提樣品DNA,一是肝胰腺組織直接抽提；二是肝胰腺培養(yǎng)液抽提，三是肝胰腺培養(yǎng)液劃板后挑取的菌落培養(yǎng)后抽提DNA。結果發(fā)現(xiàn)，肝胰腺組織直接抽提的沒有擴增出目標片段，肝胰腺培養(yǎng)液抽提和菌液抽提都能夠擴增出目標片段。結合計算時間成本和試劑成本，建議實際檢測過程中采用肝胰腺培養(yǎng)液抽提后進行PCR反應的步驟。

雙重PCR反應關鍵之一在于反應條件的優(yōu)化，尤其是引物濃度的優(yōu)化。本試驗設計了兩對引物濃度比分別在1∶1，1∶1.5，1∶2，2∶1，1.5∶1，結果發(fā)現(xiàn)引物濃度比為1∶1時效果最佳。

目前采用分子手段對AHPND進行檢測大部分是針對毒素PriA和PriB設計引物進行PCR檢測[7-8]。分析ANHND序列，發(fā)現(xiàn)AHPND攜帶的特殊質(zhì)粒上含有一段675 bp左右的冷休克蛋白(CSPs)，這些蛋白對細胞在低溫時恢復生長和發(fā)揮細胞各種功能是非常重要的。本研究是設計了兩對引物對冷休克蛋白和毒素PriA和PriB基因進行同時檢測。目的是為了增強檢測的特異性，減少假陽性的存在。

本研究建立了AHPND的雙重PCR檢測方法，并對廣州機場口岸進境的草蝦進行了監(jiān)控，對AHPNS的監(jiān)測和預防具有指導性意義。