禽腺病毒4型hexon基因克隆與原核表達(dá)分析

王許航 ， 王 林 ， 經(jīng) 美 ， 陳 萍 ， 王金鳳 ， 孫繼國,4 ， 劉聚祥,4 ， 王建昌 ， 袁萬哲,4

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 河北保定071001 ； 2.北京市動物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京大興102600 ； 3.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 ， 河北石家莊050051 ；4.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心 ， 河北保定071001)

2015年6月以來，我國山東、安徽、河北、河南、遼寧等省份肉雞群中發(fā)生了以心包積液、肝臟腫大為特征的疾病，根據(jù)病變，又將該病稱為雞心包積液-肝炎綜合征。該病多發(fā)生于20～30日齡左右的肉雞，發(fā)病后4～8 d為死亡高峰期，病程為8～15 d，死亡率達(dá)20%～30%。同時20～70日齡以及200～300日齡的蛋雞也有發(fā)生，但是死亡率低于肉雞。日前已經(jīng)確定該病病原為Ⅰ群禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4, FAdV- 4)，且為高致病性毒株，可致死雛雞[1-2]。目前，該病仍然發(fā)生與流行，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

FAdV- 4基因組大小約為45 kb。病毒編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白有六鄰體(Hexon)、五鄰體、纖突等。其中Hexon蛋白帶有屬和亞屬特異性抗原決定簇，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。基于此，本研究對禽腺病毒4型SDSX1株的Hexon基因進(jìn)行克隆并對其原核表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了重組菌pQE1-hexon以及高純度的Hexon蛋白，為進(jìn)一步研究FAdV-4檢測方法和新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 禽腺病毒4型SDSX1株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存；2×TransTaq?HiFi PCR Super Mix I、ExnaseTMⅡ 和5×CE Ⅱ Buffer，購自武漢品生科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Rosetta2(DE3) pLySs、Top10感受態(tài)和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司;6×His,His-Tag Monoclonal Antibody，購自Proteintech公司；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上登錄的SDSX1株基因序列(GenBank：KU845700)，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物，在引物序列中引入5′ linker和3′ linker，便于后續(xù)與表達(dá)載體的重組反應(yīng)。引物序列如下:上游引物P1：5′-GGGTCCAGCGGCGCTGGATCCATGGCGGCCCTCACGCCCGA-3′;下游引物P2：5′-CGCTCCACTGCCTCCTGCAGCTTACACGGCGTTGCCTGTGG-3′。預(yù)期擴(kuò)增的片段大小約為2 856 bp，引物由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 病毒Hexon基因的擴(kuò)增 利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取雞胚分離毒SDSX1株的DNA，以此DNA為模板進(jìn)行Hexon基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，PrimerSTAR Max(2x)25 μL，模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min 20 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的基因。

1.4 表達(dá)載體pQE1的擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TransTaq?HiFi PCR Super Mix I 25 μL，模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)充至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的基因。用Nanodrop分別測定目的基因Hexon和表達(dá)載體pQE1的濃度。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將Hexon目的基因與pQE1載體按一定比例進(jìn)行重組，重組反應(yīng)體系：ExnaseTMⅡ 1 μL，5xCEⅡBuffer 2 μL，Hexon目的基因3 μL，表達(dá)載體pQE1 4 μL。37 ℃反應(yīng)30 min，冰上放置5 min，將10 μL重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)到Top10菌株，冰浴30 min，42 ℃ 90 s，冰上放置2～3 min，加入900 μL SOC培養(yǎng)基，37 ℃振搖1 h，離心后剩100 μL菌液涂含Kan+抗生素的LB板。菌液PCR鑒定，將陽性菌液送至測序，測序正確的質(zhì)粒被命名為pQE1-Hexon。

1.6 重組質(zhì)粒pQE1-hexon的原核表達(dá) 將陽性重組質(zhì)粒pQE1-Hexon轉(zhuǎn)化至Rosetta2(DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞中，將重組菌于37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6，加入IPTG，使其終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)5 h，確定最適的IPTG誘導(dǎo)濃度；在最適IPTG誘導(dǎo)濃度下，分別誘導(dǎo)表達(dá)0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，確定最佳的誘導(dǎo)時間；在最適IPTG濃度和最佳誘導(dǎo)時間下，分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃誘導(dǎo)，確定最佳誘導(dǎo)溫度。菌液經(jīng)超聲波破碎后，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.7 Hexon蛋白的純化 用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白, 用Nanodrop測定Hexon蛋白的濃度和純度。

2 結(jié)果

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增 經(jīng)PCR擴(kuò)增的Hexon基因在大約2 800 bp處出現(xiàn)明顯的目的條帶，與預(yù)期的大小(2 856 bp)相符(圖1)。表達(dá)載體pQE1在大約5 400 bp處有明顯條帶，與預(yù)期的大小(5 407 bp)相符(圖2)。

圖1 Hexon 基因的PCR擴(kuò)增

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn) ； 1：Hexon基因

圖2 表達(dá)載體pQE1的PCR擴(kuò)增

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn) ； 1：pQE1基因

2.2 重組質(zhì)粒pQE1-Hexon的菌液PCR鑒定 重組質(zhì)粒pQE1-Hexon轉(zhuǎn)入Top10菌株后，經(jīng)菌液PCR鑒定，在大約2 800 bp處有明顯條帶，大小與預(yù)期的2 856 bp完全相符(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒pQE1-Hexon 的菌液PCR鑒定

M：DNA分子標(biāo)準(zhǔn)； 1-6：pQE1-Hexon基因

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 SDS-PAGE分析表明，Hexon基因可得到表達(dá)，蛋白分子質(zhì)量約為107 kD。Hexon蛋白在25 ℃、0.8 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)4 h獲得最大表達(dá)量，而未誘導(dǎo)的菌樣未出現(xiàn)條帶(圖4～6)。可溶性分析表明，重組蛋白以不溶性的包涵體形式存在于菌體中(圖7)。

圖4 不同時間pQE1-Hexon誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE檢測

M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1：為pQE1-Hexon重組質(zhì)粒未誘導(dǎo)表達(dá)時； 2-8：分別為pQE1-Hexon重組質(zhì)粒誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7 h后表達(dá)情況

圖5 不同IPTG濃度pQE1-Hexon誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE檢測

M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)； 1-8：IPTG濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L時Hexon的表達(dá)情況

圖6 不同溫度 pQE1-Hexon誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性SDS-PAGE檢測

M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)； 1～4：分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃時pQE1-Hexon誘導(dǎo)表達(dá)情況； 5：誘導(dǎo)表達(dá) 4 h時的沉淀； 6：誘導(dǎo)表達(dá)4 h時的上清2.4 重組Hexon蛋白的純化復(fù)性 經(jīng)Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，純化的蛋白經(jīng)含GSH-GSSG的PBS復(fù)性緩沖液透析復(fù)性，復(fù)性條帶大小與預(yù)期目的條帶相符(圖7)，用Nanodrop測定復(fù)性蛋白的濃度為5.165 mg/mL，純度為97%。

圖7 蛋白復(fù)性的結(jié)果

M：蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1：純化蛋白

3 討論

Ⅰ群禽腺病毒是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，呈球形，衣殼為20面體結(jié)構(gòu)，直徑約70～90 nm。病毒粒子主要由240個六鄰體和12個五鄰體基底(頂點(diǎn)殼粒)組成。每個五鄰體有一條或兩條纖突[3]，這些纖維以五鄰體蛋白為基底由衣殼伸出[4]，在頂端形成頭節(jié)區(qū)。五鄰體和纖突的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合[5]，在病毒感染細(xì)胞過程中起著非常重要的作用。病毒粒子含有約14條多肽，主要有3個結(jié)構(gòu)蛋白，分別為：六鄰體蛋白、五鄰體蛋白和纖突蛋白。禽腺病毒4型屬于Ⅰ群禽腺病毒C種成員，其代表株ON1株通過肌肉注射感染SPF雞，不能引起臨床表現(xiàn)與病理損傷，為非致病性毒株[6]，而本項(xiàng)目組本次所分離的毒株卻能引發(fā)SPF雞死亡與病理損傷[1]，為高致病性禽腺病毒4型。目前尚無表達(dá)高致病性禽腺病毒4型Hexon蛋白的報(bào)道。

六鄰體蛋白由3個相同的單體組成，其中部和C 端較保守，它是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，含有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的型特異性抗原決定簇。六鄰體的前段和中段主要是由Loop1、Loop2及P1區(qū)組成，其比較大的抗原表位區(qū)都位于前段和中段，據(jù)此推測其具有型和群特異性表位，能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體[7-8]。六鄰體后端主要由Loop4、P2區(qū)組成，盡管該區(qū)域有較好抗原性，但疏水性氨基酸殘基較多且暴露性差，說明該區(qū)域的總體抗原性較弱。因此，六鄰體的前段和中段可作為蛋白表達(dá)首選區(qū)。本研究采用qRex重組酶體系方法，將高致病性禽腺病毒4型Hexon全長基因克隆至原核表達(dá)載體pEQ1中，獲得了一種可高效表達(dá)蛋白的重組菌pQE1-Hexon以及高純度的Hexon蛋白，為進(jìn)一步研究FAdV-4檢測方法和新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。