多靶點(diǎn)調(diào)控的整合醫(yī)學(xué)模式探索治療百草枯中毒的新途徑

劉瑩，張彧，李潤玖

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧 大連 116011）

百草枯化學(xué)名稱是1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種快速滅生性除草劑，具有觸殺作用和一定內(nèi)吸作用，對(duì)人、畜具有非常大的毒性［1-3］。口服后可快速吸收，毒物吸收后引起肺出血、水腫、透明膜變性或纖維細(xì)胞增生，導(dǎo)致嚴(yán)重的難治性低氧血癥，還可累及心、肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等，導(dǎo)致多器官功能衰竭，口服中毒后死亡率高達(dá)近90%［4-6］。

整合醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)將醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域最先進(jìn)的理論知識(shí)和臨床各專科最有效的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行有機(jī)整合，是更加符合人體健康和疾病治療的新醫(yī)學(xué)體系。百草枯中毒同時(shí)存在多臟器功能障礙，救治中應(yīng)運(yùn)用整體觀、整合觀和醫(yī)學(xué)觀的原則，切實(shí)解決臨床實(shí)踐中遇到的問題。整合醫(yī)學(xué)不僅僅是醫(yī)學(xué)層面的整合，還是醫(yī)學(xué)和科學(xué)前沿的整合，特別體現(xiàn)在醫(yī)學(xué)和大數(shù)據(jù)的整合［7-8］。

由于目前缺乏特效解毒劑，口服百草枯中毒死亡率極高。能否利用已有藥物靶點(diǎn)預(yù)測的相關(guān)數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)分析百草枯的作用靶點(diǎn)，從多靶點(diǎn)調(diào)控的角度，以整合醫(yī)學(xué)模式探索治療百草枯中毒的新方法或新途徑是研究重點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)從藥物、靶點(diǎn)與疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā)，采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型表達(dá)和分析研究對(duì)象的藥理學(xué)性質(zhì)，能夠反映及闡釋藥物的多成分-多靶點(diǎn)作用關(guān)系，有望為藥物作用機(jī)制研究等帶來新突破。本研究擬從網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)的角度，通過百草枯靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)的功能富集，探討百草枯中毒的分子機(jī)制，為深入研究百草枯中毒的治療方法和手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 靶點(diǎn)預(yù)測

1.1.1 方法一：毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫 （Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org/） 收集了化合物與基因、化合物與蛋白、化合物與疾病以及基因與疾病之間的相互作用。本研究使用 CTD數(shù)據(jù)庫，以“paraquat”為關(guān)鍵詞檢索百草枯相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.2 方法二：SwissTargetPrediction （http：//www.swisst argetprediction.ch/） 是一個(gè)可精確預(yù)測生物活性分子靶點(diǎn)的服務(wù)器，這是根據(jù)已知配體的2D和3D相似性聯(lián)合檢測進(jìn)行的預(yù)測。本研究運(yùn)用SwissTargetPrediction服務(wù)器，以百草枯SMILES化學(xué)式“C ［N+］1=CC=C （C=C1） C2=CC=［N+］ （C=C2） C”為關(guān)鍵詞檢索百草枯相關(guān)靶點(diǎn)，點(diǎn)擊submit即可預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 數(shù)據(jù)建立與整理

使用 Excel建立百草枯的基因數(shù)據(jù)集，分別納入百草枯靶點(diǎn)基因，包括Gene Symbol、Gene ID、Interaction Count、Organism Count。

1.3 基因在線功能注釋

基因本體 （Gene Ontology，GO） 數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 代謝通路數(shù)據(jù)庫是目前最常用的基因功能注釋數(shù)據(jù)庫。GO數(shù)據(jù)庫是2000年構(gòu)建的一個(gè)結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)模型，涵蓋了基因的細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過程。KEGG是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，把從已經(jīng)完整測序的基因組中得到的基因目錄與更高級(jí)別的細(xì)胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能關(guān)聯(lián)起來。運(yùn)用 DAVID （https：//david.ncifcrf.gov/） ，將預(yù)測的關(guān)鍵基因靶標(biāo)進(jìn)行GO注釋和 KEGG 通路分析。

1.4 百草枯多成分-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)建立

把百草枯的靶基因根據(jù)Interaction count排序，篩選出Interaction count＞10的基因，將篩選后的靶基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫 （https：//string-db.org/） ，選擇人類復(fù)雜蛋白，物種為人類，得到靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 百草枯的靶點(diǎn)預(yù)測

SwissTargetPrediction預(yù)測結(jié)果顯示，百草枯的靶點(diǎn)包括多聚腺苷酸結(jié)合蛋白相互作用蛋白 （PABPC） 、膽堿酯酶 （BCHE、ACHE） 、Muscleblind-like蛋白 （MBNL） 等，見圖1。

CTD數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果顯示，百草枯的靶點(diǎn)包括TNF、NFE2L2、TGFB1、CAT、CASP3等2 364個(gè) 基 因，根據(jù)Interaction count進(jìn)行排序，表1列出了排名前10位的基因信息。將Interaction count＞10的67個(gè)基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)如圖2所示。

2.2 網(wǎng)絡(luò)富集分析結(jié)果GO分析

將百草枯預(yù)測獲得的靶基因進(jìn)行GO分析，如圖3所示，百草枯的作用靶標(biāo)主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、無機(jī)物質(zhì)反應(yīng)、凋亡、程序性死亡等過程。

2.3 網(wǎng)絡(luò)富集分析結(jié)果KEGG通路分析

將百草枯預(yù)測獲得的靶基因進(jìn)行KEGG分析，如圖4所示，KEGG 通路分析結(jié)果顯示，涉及107條顯著通路，主要為凋亡通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體通路等。

3 討論

整合醫(yī)學(xué)認(rèn)為，維持機(jī)體康復(fù)的根本因素是機(jī)體整體及其微觀各系統(tǒng)內(nèi)部及系統(tǒng)間的穩(wěn)定，這種穩(wěn)定在宏觀上通過機(jī)體的神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫3個(gè)系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)，而其微觀上的物質(zhì)基礎(chǔ)則是分子水平上基因穩(wěn)定表達(dá)［9］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)方法研究百草枯作用靶點(diǎn)，構(gòu)建百草枯-多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，探究百草枯毒性作用的分子機(jī)制，為整合醫(yī)學(xué)模式研究提供新思路，同時(shí)還可為百草枯中毒患者提供新的治療方案，為多靶點(diǎn)調(diào)控的整合醫(yī)學(xué)模式提供理論依據(jù)和循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

圖1 SwissTargetPrediction網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果Fig.1 The prediction result of SwissTargetPrediction website

表1 排名前10位的百草枯預(yù)測靶點(diǎn)Tab.1 Top 10 predicted targets of paraquat

目前對(duì)于百草枯中毒機(jī)制研究［10-11］尚未形成定論，還有很多未知的機(jī)制可能發(fā)揮作用。本研究運(yùn)用多種生物信息學(xué)方法構(gòu)建出百草枯-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行模式分析，得出百草枯作用通路圖，初步解析了百草枯的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。CTD 是一個(gè)強(qiáng)大的、公開可用的數(shù)據(jù)庫，旨在提高對(duì)環(huán)境變化如何影響人類健康的理解，它提供了許多可靠的信息，包括化合物-基因關(guān)系、化合物-疾病關(guān)系以及基因-疾病關(guān)系［12］。這些信息集成生物功能網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，可以幫助人們理解復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 注釋和 KEGG 通路分析，揭示出百草枯中毒涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、無機(jī)物質(zhì)反應(yīng)、凋亡、程序性死亡等生物學(xué)過程，凋亡通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體通路等。

圖2 百草枯的靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Paraquat target gene network

圖3 GO分析結(jié)果圖Fig.3 Results of GO analysis

圖4 KEGG分析結(jié)果圖Fig.4 Results of KEGG analysis

目前，關(guān)于百草枯中毒得到最普遍認(rèn)可的是活性氧造成肺損傷和纖維化［13-14］，可以簡單理解為百草枯有著很強(qiáng)的氧化性，而肺纖維化就是對(duì)這種氧化損傷的一種保護(hù)措施。但這種保護(hù)措施也是一把雙刃劍，一方面雖然緩解了百草枯造成的強(qiáng)烈氧化損傷，但是另一方面也會(huì)讓肺氣體交換功能逐漸喪失，被纖維化的肺泡細(xì)胞不具備氣體交換功能。所以百草枯患者最終基本都是窒息而死，這是極其痛苦的一種死亡方式。通過本研究預(yù)測結(jié)果進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)百草枯的作用靶標(biāo)涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；進(jìn)一步進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽堿酯酶、凋亡等靶點(diǎn)得到了相關(guān)文獻(xiàn)［15-16］證實(shí)。上述文獻(xiàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，本研究預(yù)測得到的百草枯潛在作用靶點(diǎn)有較高的準(zhǔn)確性，為進(jìn)一步構(gòu)建其多靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

本 研 究 整 合 了CTD、SwissTargetPrediction、GO、KEGG等多個(gè)數(shù)據(jù)庫，建立了百草枯靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。本研究仍存在一些不足，如百草枯靶點(diǎn)的篩選中，沒有出現(xiàn)被廣泛認(rèn)同的炎癥相關(guān)靶點(diǎn)，分析原因可能是采用的基因表達(dá)譜樣本量少。后續(xù)研究中，將進(jìn)一步增加研究樣本，考慮百草枯入血成分含量的信息，構(gòu)建權(quán)重網(wǎng)絡(luò)，利用基因和蛋白等芯片技術(shù)對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，本研究運(yùn)用基因表達(dá)譜、藥靶識(shí)別和網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)技術(shù)探討了百草枯中毒的分子機(jī)制，為同類研究提供了方法學(xué)參考。