脫氫表雄酮聯合高脂飲食誘導大鼠多囊卵巢綜合征模型的研究

劉洪祥，趙彥楠，霍佳寧，李達，馬曉欣

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產科，沈陽 110004）

多囊卵巢綜合癥 （polycystic ovary syndrome，PCOS） 是引起育齡期女性內分泌失調及不孕的最重要原因，影響約5%～10%的育齡期女性［1-4］。盡快明確PCOS的發(fā)生、發(fā)展機制是進一步治療的基礎。由于在臨床上獲取多囊卵巢標本較為困難，限制了對該疾病發(fā)生、發(fā)展機制的基礎研究，因此建立多囊卵巢動物模型對PCOS發(fā)病原因的研究以及指導臨床的診治有深遠意義。鹿特丹專家會議推薦的多囊卵巢的診斷標準： （1） 稀發(fā)排卵或無排卵； （2） 高雄激素的臨床表現和 （或） 高雄激素血癥； （3） 卵巢多囊性改變。符合上述3項中的2項即可診斷為PCOS。大多數模型具有卵巢多囊的形態(tài)改變，但理想的動物模型還應有稀發(fā)排卵和高雄血癥的特點。PCOS的建模方法很多，但尚無一種能滿足所有診斷標準的標準建模方法。本研究采用脫氫表雄酮 （dehydroepiandrosterone，DHEA） 皮下注射聯合高脂飲食 （high fat diet，HFD） 建模，探究更理想的PCOS大鼠的造模方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

選取21日齡清潔級雌性SD大鼠80只，隨機分為3組：對照組（n= 30）、實驗組（n= 30）和HFD組（n= 20）。實驗動物于中國醫(yī)科大學本溪動物實驗中心SPF級飼養(yǎng)，自由飲水、自由進食。飼養(yǎng)溫度為20～24 ℃，飼養(yǎng)環(huán)境濕度為40%～60%，每日光照及黑暗時間各12 h。

1.2 構建動物模型

所有實驗動物分組后適應性喂養(yǎng)3 d。將 DHEA［60 mg/ （kg·d）］溶于 0.2 mL 注射用油中［5-6］。對照組大鼠頸背部皮膚皮下注射0.2 mL 注射用油，實驗組大鼠頸背部皮膚皮下注射 DHEA+注射用油0.2 mL，HFD組頸背部皮膚皮下注射 DHEA+注射用油0.2 mL，同時喂以高脂飼料。

1.3 大鼠體質量監(jiān)測

測量大鼠體質量并記錄數值 （3 d/次） ，監(jiān)測大鼠體質量變化。3組大鼠在造模的第8周末晚禁食水，次日晨測量體質量。

1.4 大鼠血清激素水平測定

喂養(yǎng)8周后取材，取材前禁食水12 h。10%水合氯醛麻醉后腹主動脈取血，-4 ℃離心后取血清分裝于EP管，-80 ℃凍存。應用放射免疫法測定睪酮水平。

1.5 大鼠卵巢質量測定及組織學檢查

解剖雙側卵巢，去除卵巢表面的脂肪組織及其覆蓋包膜，稱量卵巢質量，稱重后立即用生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中。常規(guī)脫水、石蠟包埋。 每個蠟塊分別以 4 μ m 厚度切片多次，常規(guī) HE染色。

1.6 統計學分析

應用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行統計學分析，計量資料以表示，進行t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠實驗前后體質量及血清睪酮含量變化

HFD組及實驗組大鼠體質量與對照組大鼠相比，無統計學差異 （P＞ 0.05） 。HFD組與實驗組均有明顯高雄激素血癥表現，血清中睪酮含量均較對照組有統計學差異 （P＜ 0.05） 。見表1。

表1 各組大鼠體質量及睪酮水平比較Tab.1 Animal weight and serum concentration of TESTO in each group

2.2 各組大鼠卵巢形態(tài)學變化

實驗組和HFD組大鼠卵巢表面蒼白，包膜增厚，可見囊狀卵泡形成。其中HFD組囊狀卵泡數量和卵泡數量比值較實驗組變化更加明顯。見表2。對照組卵巢表面顏色紅潤，未見明顯囊狀卵泡突起。

2.3 各組大鼠卵巢病理學變化

HFD組及實驗組大鼠卵巢均可見明顯囊性擴張的卵泡，其卵泡內卵母細胞消失，卵巢顆粒細胞層數減少至2～3層，囊狀擴張卵泡數量明顯增多。HFD組囊狀卵泡與卵泡總數比值較實驗組更大。對照組可見數個黃體及不同發(fā)育時期的卵泡，卵巢顆粒細胞層數為8～9層。見圖1。

表2 實驗組和HFD組大鼠卵巢形態(tài)學比較Tab.2 Pathological changes in the ovaries of rats in the experimental group and the high-fat diet group

圖1 各組大鼠卵巢組織HE染色切片Fig.1 Representative images of HE staining of ovarian sections from a single rat in each group

3 討論

PCOS是影響育齡期女性最常見的內分泌疾病，近年來研究［1-2，7］表明，該疾病與腹型肥胖、胰島素抵抗、二型糖尿病等密切相關。有研究［6］表明，長期暴露于雄激素環(huán)境中，大鼠可以表現出典型的PCOS特點，包括肥胖、胰島素抵抗這些代謝紊亂的表現及卵巢多囊樣改變的病理生理特點。MIAO等［8］采用DHEA皮下注射成功構建起大鼠PCOS模型，且卵巢病理學改變及血清生化指標檢驗接近實際臨床病例。本研究采用DHEA構建PCOS模型，其主要原理為在卵泡膜細胞上DHEA能促進睪酮經Δ4途徑的合成，導致血睪酮水平升高，從而引起卵泡閉鎖，無排卵。本研究中實驗組及HFD組卵巢表面蒼白且呈多囊性改變，閉鎖卵泡直徑增大，卵母細胞或放射冠缺失，顆粒細胞層數減少，白膜增厚，與國內外研究［1-2，6-8］一致。然而在本研究中，實驗組大鼠并沒有表現出明顯的體質量增長變化，導致這種現象發(fā)生的原因可能和飲食等環(huán)境因素有關。但也有文獻［9］報道，DHEA可能會引起小鼠能量攝入降低，從而導致體質量減輕，肥胖女性口服DHEA-S可能通過將DHEA轉換為雌激素降低脂肪含量增加而降低體質量［10］。

研究［3］表明，在高脂飼養(yǎng)條件下，大鼠會發(fā)生代謝改變并加劇大鼠發(fā)生多囊卵巢樣改變。有實驗［11］證明，對大鼠喂以高脂飼料可加劇大鼠表現出肥胖、胰島素抵抗和抑郁行為等癥狀，有文獻［12］報道，飲食可以誘導肥胖小鼠血液中睪酮含量明顯升高，AKAMINE等［13］給予大鼠HFD后，模型組腹膜后及性腺周圍脂肪、胰島素抵抗指數均明顯升高，這些表現符合PCOS的一般表現及代謝特點。然而，單獨應用HFD構建PCOS模型耗時久，在血清性激素水平和卵巢形態(tài)學改變方面不典型，因此HFD常與激素誘導聯合應用。DHEA造模法具有明顯的胰島素抵抗這一特點［14］。因此，本研究在DHEA的基礎上聯合HFD構建大鼠PCOS模型。本研究中2種建模方法均成功構建出大鼠PCOS模型，2種造模方法的大鼠均表現出高雄激素血癥，卵巢均發(fā)生多囊樣改變，但DHEA聯合HFD造模法較單純DHEA造模法卵巢形態(tài)學及組織病理學變化更加顯著。

綜上所述，DHEA聯合HFD構建PCOS大鼠模型在血清激素水平及組織病理學上變化更加明顯，模型大鼠表現出不排卵及卵巢多囊樣改變，是一種可靠的PCOS動物建模方法。