硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

徐偉　耿士偉　劉路　程鳳科　還靜　孫政國(guó)

摘 要：本文介紹了硝基呋喃類藥物種類、理化性質(zhì)及其危害，總結(jié)了膠體金免疫、酶聯(lián)免疫、高效液相色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜等目前檢測(cè)硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留的常用方法研究進(jìn)展，并對(duì)該類藥物檢測(cè)方法的應(yīng)用提出了相關(guān)建議。

關(guān)鍵詞：硝基呋喃類藥物及代謝物；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：O657.63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.08.005

Abstract： This paper introduced the species， the physicochemical properties and the harms of nitrofuran antibiotics， summarized the research progress of common methods of gold immunochromatography assay （GICA）， enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）， high performance liquid chromatography（HPLC） and liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）， of the nitrofuran antibiotics and their metabolites residues， and offered some suggestions for the application of drug detection method.

Key words： nitrofuran antibiotics and their metabolites； detection method； research progress

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗菌藥物，由于其價(jià)格低廉、抗菌效果好，被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)、蜂等動(dòng)物傳染病的預(yù)防和治療，部分品種具有促生長(zhǎng)作用，可用作飼料添加劑。但由于該類抗生素是致癌物，引起世界各國(guó)普遍關(guān)注，并逐步完善對(duì)該類藥物的控制規(guī)定，1990年歐盟頒布的2377/90/EEC條例將硝基呋喃類藥物及其代謝物列為A類禁用藥物，1995年禁止在食用動(dòng)物中使用硝基呋喃類抗生素[1]；美國(guó)于1993年禁止呋喃唑酮作為獸藥使用[2]，2004年，美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）公布禁止在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中使用呋喃西林和呋喃唑酮[3]；2002年我國(guó)頒布的農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告明令禁止使用呋喃唑酮和呋喃它酮，2005年頒布的農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告將呋喃妥因和呋喃西林列入首批《獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》。

1 硝基呋喃類藥物簡(jiǎn)介

1.1 藥物種類及理化性質(zhì)

硝基呋喃類藥物是呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基團(tuán)的一類人工合成抗菌藥，包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因[4]。由于該類藥物都具有C=N雙鍵和5-硝基呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)，所以四種藥物具有相似的理化性質(zhì)，無(wú)臭，味苦，為性質(zhì)穩(wěn)定的黃色結(jié)晶粉末。對(duì)光敏感、代謝快，在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期不過(guò)數(shù)小時(shí)，但其代謝物（表1[5]）分子可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的蛋白結(jié)合物。

1.2 藥物作用及其危害

硝基呋喃類藥物抗菌機(jī)理是干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，使細(xì)菌代謝紊亂[6]，低濃度下對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲有抑制作用，高濃度下有殺滅作用，常用于治療和預(yù)防畜禽及水產(chǎn)類因感染大腸桿菌和沙門氏菌而產(chǎn)生的疾病。呋喃唑酮常被用于治療原蟲或細(xì)菌引起腸炎、痢疾、腹瀉等腸道性疾病，有“痢特靈”稱號(hào)；呋喃西林僅用于消毒防腐；呋喃妥因主要用于細(xì)菌引起的泌尿系統(tǒng)感染；呋喃它酮在腸道不容易被吸收，主要用于治療腸道感染[7]。

硝基呋喃類藥物的危害主要表現(xiàn)為[8-11]：（1）對(duì)畜禽毒性作用。大劑量或長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用硝基呋喃類藥物均能對(duì)畜禽產(chǎn)生毒性作用，其中呋喃西林的毒性最大，呋喃唑酮的毒性最?。唬?）具有致癌致畸致突變作用。呋喃它酮為強(qiáng)致癌藥物，呋喃唑酮具有中等強(qiáng)度致癌性，可誘發(fā)乳腺癌和支氣管癌，同時(shí)還具有繁殖毒性，并且可以引起細(xì)菌突變；（3）代謝物對(duì)人體危害嚴(yán)重。該類藥物在人體內(nèi)代謝迅速，而代謝物可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定并可以在弱酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)，因此，當(dāng)人體攝入含有該類藥物殘留的食品后，代謝物在胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)危害人體健康。

2 硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測(cè)方法

由于硝基呋喃類藥物具有對(duì)光敏感、代謝快的特點(diǎn)，而代謝物可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，因此，通常以測(cè)定代謝物殘留量來(lái)判斷硝基呋喃類藥物使用情況。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的硝基呋喃類藥物及其代謝物檢測(cè)方法主要有膠體金免疫法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。

2.1 膠體金免疫法（GICA）

膠體金免疫法（GICA）是一種前處理簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，通過(guò)肉眼判斷的快速定性檢測(cè)方法。何方洋等[12]研制了飼料中硝基呋喃抗生素膠體金檢測(cè)試紙條，呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因最低檢測(cè)限分別達(dá)到5，3，2，2 μg·kg-1，假陽(yáng)性率為2%，假陰性率為0。李軍等[13]研發(fā)的試紙條可檢測(cè)8種硝基呋喃類藥物，檢測(cè)限范圍為0.2～0.8 μg·g-1。張曉麗等[14]制備了AMOZ膠體金試紙條，靈敏度為5 μg·L-1，樣品前處理完成后只需3～5 min可觀察結(jié)果。徐向霞等[15]研制的用于檢測(cè)豬肉中AHD試紙條檢測(cè)限為2.33 μg·L-1，整個(gè)檢測(cè)流程不超過(guò)5 min。趙正苗等[16]應(yīng)用GICA法檢測(cè)雞肉、豬肉、魚、蝦中SEM，檢測(cè)限為1.0 μg·kg-1，假陰性率為0，假陽(yáng)性率小于5%。柳愛春等[17]建立了水產(chǎn)品中4種硝基呋喃代謝物GICA法，研制了免疫膠體金快速檢測(cè)試劑盒，對(duì)AOZ最低檢出限為0.5 μg·kg-1，對(duì)AMOZ、AHD和SEM最低檢出限為1.0 μg·kg-1，其檢測(cè)結(jié)果通過(guò)LC-MS/MS法確證，符合率為98%。

2.2 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

酶聯(lián)免疫法（ELISA）是一種特異性較強(qiáng)、靈敏度高的半定性定量的檢測(cè)法，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短，可實(shí)現(xiàn)大批量樣品同時(shí)檢測(cè)，因此常作為篩選方法用于藥物殘留分析。2004年，Cooper等[18]首次制備得到了AOZ的多隆抗體，并提出了蝦組織中AOZ檢測(cè)的ELISA法，該方法的建立為硝基呋喃代謝物的ELISA檢測(cè)法發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。之后，Cooper等[19]又報(bào)道了SEM的ELISA檢測(cè)法，檢測(cè)限為0.21 μg·kg-1，定量限為0.25 μg·kg-1。Pimpitak等[20]建立的AMOZ的ELISA檢測(cè)法的檢測(cè)限為0.16 μg·kg-1，定量限為0.2 μg·kg-1。Jiang等[21]報(bào)道的AHD的ELISA法，檢測(cè)限低于0.2 μg·kg-1。以上4種方法的建立，都是間接法測(cè)定代謝物含量，即通過(guò)檢測(cè)代謝物的衍生物來(lái)確定樣品中代謝物的含量。2012年，Yan等[22]首次提出了肉類中AMOZ的ELISA檢測(cè)法，檢測(cè)限可達(dá)到0.4 ng·g-1，回收率為85.0%～103.0%。在國(guó)內(nèi)，羅杰、李健[23]建立了水產(chǎn)品呋喃唑酮間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)法，最小檢測(cè)限為1 ng·mL-1。徐一平等[24]建立了AHD的ELISA檢測(cè)法，檢測(cè)限為0.085 mg·mL-1，并通過(guò)豬肉樣品添加回收率的測(cè)定，證明了該方法的準(zhǔn)確性?，F(xiàn)在市場(chǎng)如德國(guó)R-Biopharm、英國(guó)RANDOX等公司均有成熟的產(chǎn)品。

2.3 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法是檢測(cè)硝基呋喃類藥物及其代謝物的常用方法之一。2001年農(nóng)業(yè)部農(nóng)牧發(fā)[2001]38號(hào)[25]文件中發(fā)布的呋喃唑酮的液相色譜-紫外檢測(cè)器（LC-UV）檢測(cè)方法，在雞的肌肉組織、肝臟、腎臟和魚肉中的檢測(cè)限分別為10，50，50，25 μg·kg-1，回收率分別為80%～110%，60%～130%，50%～140%，70%～120%。農(nóng)業(yè)部1486號(hào)公告-8-2010[26]中使用LC-UV同時(shí)檢測(cè)飼料中4種硝基呋喃類藥物，檢測(cè)限均為0.3 mg·kg，定量限均為1.0 mg·kg-1。賈濤[27]使用乙腈提取，濃縮后用2%甲酸復(fù)溶，經(jīng)混合型陽(yáng)離子交換柱凈化，通過(guò)液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)飼料中硝基呋喃類藥物，發(fā)現(xiàn)以365 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，4種物質(zhì)峰形最好，檢測(cè)限達(dá)到150 μg·kg-1，當(dāng)添加濃度為1 mg·kg-1時(shí)，平均回收率（n=6）在80.9%～86.5%，符合化合物痕量分析的準(zhǔn)確度要求。葛寶坤等[28]采用固相萃取（SPE）前處理凈化技術(shù)，建立了雞肉、魚、蝦中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮藥物L(fēng)C-UV測(cè)定法，3個(gè)不同水平的添加回收率（n=7）為87%～102%，檢出限分別達(dá)到5，2，3，5 μg·kg-1。于慧娟等[29]通過(guò)LC-UV法測(cè)定水產(chǎn)品中呋喃唑酮的殘留量，檢測(cè)限可達(dá)到1 μg·kg-1。Angelini等[30]利用LC-UV方法檢測(cè)牛肌肉中4種硝基類藥物，檢測(cè)限和定量限分別達(dá)到1 μg·kg-1和2 μg·kg-1。

由于呋喃結(jié)構(gòu)的紫外光譜吸收不明顯，導(dǎo)致靈敏度降低，不能達(dá)到檢測(cè)要求，但經(jīng)衍生化后，硝基呋喃類代謝物可產(chǎn)生較強(qiáng)的紫外吸收，使其檢測(cè)限提高到1 μg·kg-1。王媛等[31]通過(guò)將樣品酸解，2-氯苯甲醛衍生后用乙酸乙酯萃取，SPE柱凈化，建立了水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)方法，在5.0～500 μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，定量限為1.0 μg·kg-1，在2個(gè)添加濃度水平的平均回收率為76%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%（n=6）。Chumanee等[32]采用2-萘甲醛衍生化方法，通過(guò)液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)蝦肉中4種硝基呋喃代謝物，檢測(cè)限達(dá)到1 μg·kg-1。

2.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）

LC-MS/MS法因其具有靈敏度高、檢測(cè)限低、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量準(zhǔn)等特點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用于硝基呋喃代謝物檢測(cè)和確證。我國(guó)針對(duì)不同基質(zhì)背景樣品中硝基呋喃代謝物檢測(cè)發(fā)布了各種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，如GB/T 20752-2006、GB/T 21166-2007、GB/T 21311-2007、農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-4-2006、農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-2-2008等，其最低檢測(cè)限均小于或等于0.5 μg·kg-1，均低于歐盟規(guī)定的1 μg·kg-1的最低檢測(cè)限量要求。2001年Alexander等[33]提出了用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法分析動(dòng)物肌肉組織中4種硝基呋喃代謝物的方法，通過(guò)酸性水解、2-硝基苯甲醛衍生和固相萃取凈化等步驟，呋喃唑酮代謝物（AOZ）、呋喃它酮代謝物（AMOZ）、呋喃西林代謝物（SEM）、呋喃妥因代謝物（AHD）的檢測(cè)限分別是0.5，0.5，3.0，5.0 ng·g-1，定量限分別是2.5，2.5，10.0，10.0 ng·g-1。Pascal等[34]建立的肉中4種代謝物的HPLC-MS/MS檢測(cè)法，內(nèi)標(biāo)法定量，最低檢測(cè)限為0.11～0.21 μg·kg-1，定量限為0.19～0.36 μg·kg-1。在國(guó)內(nèi)，2003年彭濤等[35]利用 HPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物肌肉中四種代謝物殘留量，AOZ和AMOZ檢測(cè)限達(dá)到0.05 ng·g-1，定量限達(dá)到0.1 ng·g-1，SEM和AHD檢測(cè)限為0.1 ng·g-1，定量限為0.5 ng·g-1，在添加濃度0.5～10 ng·g-1范圍內(nèi)，平均回收率為60%～95%。余建新等[36]建立的蜂蜜和水產(chǎn)品中4種硝基呋喃代謝物HPLC-MS/MS方法中檢測(cè)限可達(dá)到0.02～0.3 ng·g-1，回收率為79.0%～95.6%。

隨著超高效液相色譜（UPLC）的普及應(yīng)用，加上內(nèi)標(biāo)物可降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響，一些學(xué)者將兩者相結(jié)合，建立了不同樣品中硝基呋喃代謝物UPLC-MS/MS方法，提高了檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，節(jié)省了測(cè)定時(shí)間。廖妍儼等[37]建立了動(dòng)物源性食品中4種硝基呋喃代謝物的UPLC-MS/MS方法，檢出限均為0.25 μg·kg-1，回收率為81.6%～97.3%。尹暉等[38]開發(fā)的雞蛋中硝基呋喃代謝物檢測(cè)方法，簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，對(duì)凈化步驟進(jìn)行了優(yōu)化，檢測(cè)限均為0.25 ng·g-1，在0.5～5 ng·g-1添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率為79.1%～109.4%。劉柏林等[39]利用UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品（魚類及蝦類）中4種硝基呋喃代謝物，SEM和AHD最低檢出限為0.1 μg·kg-1、AOZ和AMOZ最低檢出限為0.05 μg·kg-1，平均回收率在91.8%～107.0%之間。華正罡等[40]針對(duì)雞肉中硝基呋喃代謝物建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)法，AOZ、AMOZ、SEM和AHD最低檢出限可達(dá)至0.005，0.005，0.01，0.01 μg·kg-1，平均回收率穩(wěn)定在92%～95%，進(jìn)一步降低了檢出限，提高了準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

目前，用于硝基呋喃類抗生素及其代謝物檢測(cè)的方法主要有膠體金免疫法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜及其串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是自動(dòng)化和精確度高，但受基質(zhì)效應(yīng)干擾容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且儀器昂貴，操作繁瑣、前處理復(fù)雜，需要專業(yè)分析人員。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法特異性更強(qiáng)，靈敏度和精確度更高，檢測(cè)限更低，但也存在成本高、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，但無(wú)法進(jìn)行定量檢測(cè)，同時(shí)存在出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)于不同環(huán)節(jié)、不同樣品需要結(jié)合實(shí)際情況選擇適合方法或是幾種方法配合使用，達(dá)到結(jié)果更準(zhǔn)、效率更高、投入更少的目的。另外，在選擇使用液相色譜或串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法時(shí)，建議使用內(nèi)標(biāo)法定量，不但可以降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾，還可以避免前處理過(guò)程中目標(biāo)成分丟失而造成的定量不準(zhǔn)確。選擇酶聯(lián)免疫法或膠體金免疫法時(shí)，應(yīng)選擇質(zhì)量合格且性能穩(wěn)定的產(chǎn)品，并在使用前對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證。

硝基呋喃代謝物需要通過(guò)衍生增大分子量，改善其色譜行為，提高離子化效率，提升檢測(cè)靈敏度。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)內(nèi)外報(bào)道的文獻(xiàn)中大多數(shù)是通過(guò)加入2-硝基苯甲醛在37 ℃恒溫衍生16 h，大大延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)效率，特別是在遭遇緊急突發(fā)事件時(shí)，延緩了檢測(cè)機(jī)構(gòu)結(jié)果上報(bào)。目前，部分文獻(xiàn)報(bào)道使用新型衍生化試劑可以縮短衍生時(shí)間達(dá)到較低的檢測(cè)限和較好的回收率[31，41-42]，筆者曾通過(guò)將溫度提升至60 ℃，連續(xù)4 h衍生得出檢測(cè)結(jié)果與連續(xù)衍生16 h差異不大，但大范圍推廣應(yīng)用還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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