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    DNAJA1過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞的鑒定

    2018-11-09 03:20:06易禮智王琴程征宇通訊作者
    醫(yī)藥前沿 2018年33期
    關(guān)鍵詞:變性膠質(zhì)瘤質(zhì)粒

    易禮智 王琴 程征宇(通訊作者)

    (樂山市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 四川 樂山 614000)

    近年來,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,結(jié)直腸癌的病死率有所下降,但它仍是人類最常見的惡性腫瘤之一,且它的發(fā)病率有逐年上升的趨勢[1]。DNAJA1是熱休克蛋白40家族(也稱DNAJ家族)成員之一,主要負(fù)責(zé)如展開錯誤折疊的蛋白質(zhì)、折疊多肽鏈、參與多肽的跨膜運輸、組裝及拆卸蛋白質(zhì)復(fù)合物并控制、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生成等細(xì)胞生理活動[2-3]。近年來,DNAJA1越來越多地出現(xiàn)在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的研究報道中。在敲除DNAJA1的小鼠C6惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的研究中,發(fā)現(xiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞敲除DNAJA1后,細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)[4]。另外,DNAJA1可以增強(qiáng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療抵抗性[5]。但目前,DNAJA1在結(jié)直腸癌中的作用尚無文獻(xiàn)報道。

    1.材料與方法

    1.1 材料

    Lipofectamine2000、Trlzol購自life公司;PCR試劑盒、T4 DNA連接酶和DNA Marker均購自Promega公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提取試劑盒均購自QIA InC公司;限制性內(nèi)切酶KpnI、Xhol購自NEB公司。

    1.2 方法

    1.2.1 PCR擴(kuò)增目的基因 DNAJA1(NM_001314039.1)的擴(kuò)增編碼區(qū)序列(CDS區(qū))總共723個堿基。利用primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計。以人正常結(jié)直腸cDNA為模板對目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,62℃退火40s,72℃延伸90s,完成35個循環(huán)后再延伸5min。擴(kuò)增完成后,分別取5ul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(1.5%)凝膠電泳鑒定。

    1.2.2 瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞 用含10%胎牛血清的RPMI.1640培養(yǎng)基培養(yǎng)6株結(jié)直腸癌細(xì)胞并放置在37℃、5%的C02培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前l(fā)天將HT29和HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)種至6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合到60%~70%時,以脂質(zhì)體(Lip0fectamineTM2000)為載體分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-DNAJA1和空白質(zhì)粒pEGFP-C1,48 h后收集細(xì)胞,進(jìn)行Real-time PCR及Western-blot檢測。

    1.2.3 Real-time PCR收集細(xì)胞,按Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑說明書分別提取RNA及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。DNAJA1上游引物 5’CCTTCAT TTGGATT CTTATCAGG3’;下游引物5’GAGCCAAAACCACCACCTGC3’;GAPDH 上游:5'-GTCCACCACCCTGTTG CTGTA-3';下游:5'-CTTCAACAGCGACACCCACTC-3'。PCR反應(yīng)體系10ul,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min,95℃變性10s,60℃退火40s,72℃延伸30s,共40個循環(huán)。根據(jù)PCR反應(yīng)曲線得到各樣品目的基因和看家基因的Ct值,計算2-ΔΔCt值進(jìn)行相對定量。

    1.2.4 Western blot檢測:細(xì)胞總蛋白提取及濃度測定按說明書操作。蛋白變性、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉1h,用兔抗人DNAJA1單克隆抗體(1∶300)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1000),4℃過夜孵育,PBST溶液洗膜三次,每次10分鐘,羊抗鼠、兔IgG二抗(1∶10000),室溫孵育1h,發(fā)光顯影。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    本研究的實驗數(shù)據(jù)運用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(δ±s)表示,各項指標(biāo)的兩樣本均數(shù)的比較采用獨立樣本的檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2.結(jié)果

    圖1 DNAJA1 在6株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mRNA(圖A)和蛋白水平檢測(圖B)

    圖2 DNAJA1過表達(dá)載體的構(gòu)建(圖A)及在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和HT29中的mRNA(圖B)和蛋白水平檢測(圖C)

    2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞株中DNAJA1的含量

    Real-time PCR 及 Western blot檢測6株結(jié)直腸癌細(xì)胞:HCT-116、HT-29、LoVo、SW620、SW480、174T 中 DNAJA1 mRNA及蛋白水平。結(jié)果顯示:DNAJA1在HCT116及HT29細(xì)胞中的mRNA及蛋白水平較低,在LoVo和SW620中的含量較高(見圖1)。故選擇HCT116和HT29細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染DNAJA1基因過表達(dá)重組質(zhì)粒。

    2.2 DNAJA1過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    以重組質(zhì)粒為DNA模板,進(jìn)行DNAJA1 PCR 擴(kuò)增實驗、凝膠電泳鑒定(圖2A),為保證合成的DNAJA1基因編碼區(qū)序列定向克隆至pEGFP-C1表達(dá)載體,進(jìn)行DNA測序鑒定及BLAST比對,顯示插入的堿基序列片段與目的基因完全一致,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時,我們將DNAJA1 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HT29和HCT116細(xì)胞。Real-time PCR及 Western blott 結(jié)果顯示,HT29和HCT116細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染DNAJA1過表達(dá)質(zhì)粒后,DNAJA1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著增高(見圖2B和2C)。以上結(jié)果顯示,DNAJA1過表達(dá)質(zhì)粒在結(jié)直腸癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染及表達(dá)成功。

    3.討論

    DNAJA1是HSP40蛋白家族成員之一,在與腫瘤相關(guān)的研究中,DNAJA1參與了包括蛋白降解[6]、侵襲[4]和凋亡[7]等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞生理活動。在胸膜惡性間皮瘤中,DNAJA1的低表達(dá)與病人在術(shù)后短期內(nèi)復(fù)發(fā)相關(guān)[8]。但它在結(jié)直腸癌中功能還沒有進(jìn)行深入的研究。

    本篇文章中,我們首先檢測了DNAJA1在6株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)在高轉(zhuǎn)移和侵襲的SW620和LoVo細(xì)胞中DNAJA1表達(dá)較高,而在低轉(zhuǎn)移的HCT116和HT29中,表達(dá)較低。這可能表明DNAJA1 在結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中有重要作用。但這與之前報道的在惡性膠質(zhì)瘤中敲除DNAJA1后促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲的結(jié)論截然不同[4]。因此為了進(jìn)一步研究DNAJA1在結(jié)直腸癌中的作用及分子機(jī)制,接下來,我們以人正常的結(jié)直腸cDNA為模板對DNAJA1因進(jìn)行擴(kuò)增。DNAJA1基因開放閱讀框全長723bp,我們利用primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性克隆以及反復(fù)驗證,成功將全長DNAJA1基因克隆至過表達(dá)載體pEGFP-C1中,并借助脂質(zhì)體將其瞬時轉(zhuǎn)染至HCT116和HT29細(xì)胞,經(jīng)Realtime和Westen-blot檢測表明pEGFP-C1-DNAJA1過表達(dá)載體構(gòu)建成功,并在SW480細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)染率較高,這為我們下一步進(jìn)行更深入的研究創(chuàng)造了條件。

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