右美托咪定預處理對腎小管上皮細胞缺氧/復氧損傷的抗炎作用

楊春梅 于明懂 王玉波高春霖

(1.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300060； 2.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津 300211)

重型顱腦創(chuàng)傷、胸腹主動脈瘤手術、休克等均可誘發(fā)腎臟缺血再灌注損傷，進而導致急性腎衰竭，嚴重威脅患者生命[1]。腎缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程，其中炎癥反應在腎缺血再灌注損傷中起著重要作用。腎小管上皮細胞對缺血缺氧、中毒、膿毒血癥等損傷因素非常敏感，是腎缺血再灌注時最易受到損害因素攻擊的靶細胞，也是腎組織炎癥介質的主要來源[2]。實驗研究[3]表明，右美托咪定可減輕腎缺血再灌注損傷，本研究擬重點從免疫因子的變化初步探討右美托咪定預處理對缺氧/復氧誘導下人腎小管上皮細胞的保護作用，為腎缺血再灌注損傷的保護提供新策略。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人腎小管上皮細胞系HK-2(ATCC公司)復蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO，美國)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。待細胞80%融合時，用0.05%胰蛋白酶(GIBCO公司)消化傳代培養(yǎng)。

1.2 實驗分組

采用隨機數(shù)字表法分為4組(n=24)：正常對照組(CON組)、右美托咪定組(DEX組)、缺氧復氧組(H/R組)、缺氧復氧+右美托咪定組(H/R+DEX組)。DEX組和H/R+DEX組加入0.1 nmol/L的右美托咪定(批號：09081232，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)孵育2h，隨后CON組和DEX組細胞置于37℃含(5%CO2-21%O2-74%N2)常氧恒溫細胞培養(yǎng)箱28 h，H/R組和H/R+DEX組細胞置于37 ℃含(5%CO2-1%O2-94%N2)的厭氧培養(yǎng)罐中缺氧培養(yǎng)24 h后，取出置于37℃含(5%C02-21%02-74%N2)常氧恒溫細胞培養(yǎng)箱進行復氧培養(yǎng)4 h。

1.3 形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下直接觀察各組細胞生長狀況并拍照。

1.4 MTT法測定細胞活力

取對數(shù)生長期的HK-2稀釋成細胞懸液，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度為1.5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，200 μl/孔，孵育24 h后，每組取6孔，每組給予相應處理后，隨后加入MTT溶液100 μl/孔，37 ℃避光孵育4 h后，小心棄上清液，加入DMSO 150 μl/孔，振蕩混勻10 min，采用ST-360酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司)，在570 nm波長處測定各孔的吸光度值(OD值)，以此反映細胞活力，實驗重復3次。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附檢測

按照 ELISA試劑盒說明，檢測培養(yǎng)細胞的上清液TNF-α、IL-1β、IL-10的濃度，通過酶標儀( MK3 LAB芬蘭)檢測 450 nm的吸光度，所有吸光度結果通過標準曲線標準化，計算出樣品水平。實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1倒置顯微鏡下，CON組和DEX組細胞貼壁良好，形態(tài)正常，H/R組活細胞數(shù)減少，懸浮細胞增多，呈水泡樣變性，H/R+DEX組細胞狀態(tài)較H/R狀態(tài)明顯改善。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下各組細胞生長狀態(tài)

2.2與CON組相比，H/R組和H/R+DEX組細胞活力明顯降低(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+DEX組細胞活力明顯升高，見表1。

表1 四組細胞活力的比較

注：與CON組比較，aP<0.05;與H/R組比較，bP<0.05。

2.3與CON組相比，H/R組和H/R+DEX組細胞TNF-α、IL-1β濃度明顯升高、IL-10濃度明顯降低(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+DEX組細胞TNF-α、IL-1β濃度明顯降低，IL-10濃度明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 四組細胞TNF-α、IL-1β及IL-10濃度的比較

注：與CON組比較，aP<0.05；與H/R組比較，bP<0.05。

3 討 論

預實驗結果表明0.1 nmol/L右美托咪定預處理2 h減輕缺氧復氧細胞損傷的效應最為明顯，因此選擇右美托咪定濃度0.1 nmol/L，預先給藥時間為2 h。本研究結果表明與H/R組比較H/R+DEX組細胞狀態(tài)改善，細胞活力升高，提示缺氧復氧條件下，右美托咪定預處理可減輕HK-2細胞的損傷。在缺血、缺氧等各種應激條件下，毛細血管內皮細胞損傷，白細胞聚集、黏附、激活血小板，釋放大量的炎癥介質，直接介導了腎臟間質內的巨噬細胞的微環(huán)境發(fā)生改變，而活化的白細胞在微血管內聚集，又釋放大量的炎性介質，吸引更多的中性粒細胞聚集、浸潤，加重炎癥反應，造成惡性循環(huán)[4]。促炎和抗炎是一個相互作用的過程，且炎癥反應發(fā)生后即出現(xiàn)抗炎癥反應，TNF-α、IL-1β是兩個重要的炎癥細胞因子。在缺血再灌注期間，TNF-α、IL-1β釋放增加，而IL-1β是炎癥反應早期階段產(chǎn)生的多潛能細胞因子，它可以誘導 TNFα、IL-6和 IL-8等細胞因子的產(chǎn)生，在急性腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[5-6]，是引起腎小管上皮細胞炎性損傷和凋亡的關鍵效應分子。IL-10是重要的負免疫調節(jié)因子，可抑制炎癥因子和趨化因子的釋放，從而抑制缺血后炎癥反應和免疫損傷，減少腎缺血后的細胞壞死[7]。DEX預處理可通過激動α2受體而達到抑制交感興奮、免疫調節(jié)、抗感染等作用，并通過這些途徑實現(xiàn)對各重要器官的保護作用[8]。本實驗中，與CON組相比，H/R組和H/R+DEX組細胞狀態(tài)轉壞，細胞活性和IL-10濃度下降，TNF-α、IL-1β濃度升高；而與H/R組相比，H/R+DEX組細胞活性和IL-10濃度升高，TNF-α、IL-1β濃度降低；提示右美托咪定預處理可通過抑制缺氧復氧引起的炎癥反應，減輕腎小管上皮細胞損傷，但其具體機制有待進一步探討。

綜上所述，右美托咪定預處理可以抑制缺氧復氧引起的腎小管上皮細胞的損傷，并減輕其炎癥反應。