茶樹CsCCD1和CsCCD4基因的克隆和表達(dá)分析

王 贊，岳 川，曹紅利，郭雅玲

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院, 茶學(xué)福建省高校重點實驗室, 福州 350002)

類胡蘿卜素是一類異戊二烯四萜類化合物，總數(shù)超過700種，大部分來源于具有40個碳骨架的四環(huán)戊二烯(C40)[1]。類胡蘿卜素為植物花、葉、莖和果實提供豐富的顏色，參與了光能捕獲、傳遞和光保護(hù)過程[2]，并在酶的作用下形成重要的植物激素前體化合物和具花果香的揮發(fā)性物質(zhì)[3]。

Tan等[4]第一次從玉米胚胎中鑒定出與ABA合成代謝相關(guān)的類胡蘿卜素裂解氧化酶VP14，根據(jù)同源性分析在擬南芥中確定9條類胡蘿卜素裂解氧化雙加氧酶基因[5]，分為類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因(carotenoid cleavage dioxygenases,CCD)和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因(nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenases,NCED)[6]。其中，NCED是ABA合成的關(guān)鍵基因[7]，CCD7和CCD8是獨腳金內(nèi)酯合成的關(guān)鍵基因[8-9]。CCD1和CCD4則氧化裂解多種類胡蘿卜素和脫輔基類胡蘿卜素，生成具有花果香氣的香氣物質(zhì)[10-11]，如β-紫羅酮、α-紫羅酮、香葉基丙酮和二氫海葵內(nèi)酯等[12]，是園藝植物中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。Rubio等[13]發(fā)現(xiàn)無論在藏紅花(Crocussativus)或者大腸桿菌中，藏紅花CsCCD1和CsCCD4都可以通過β-胡蘿卜素生成β-紫羅酮。

香氣是烏龍茶重要的品質(zhì)因子之一，也是評判烏龍茶做青質(zhì)量的重要因素，在做青過程中主要產(chǎn)生各種揮發(fā)性物質(zhì)，才能形成烏龍茶天然花果香的獨特風(fēng)格[14-16]。烏龍茶香氣主要包括萜類、類胡蘿卜素類、脂類及糖苷衍生物，烏龍茶香氣形成機(jī)制之一是類胡蘿卜素氧化裂解[17]，從而產(chǎn)生β-紫羅酮、香葉基丙酮、茶香螺酮等香氣組分[18]。通過PCA分析顯示β-紫羅酮是烏龍茶特征性香氣成分[19]，這些香氣成分具有低閾值的特點，比如β-紫羅酮閾值為0.2 μg/L，因此在形成烏龍茶天然花果香中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20-21]。Wang等[22]研究表明茶葉中富含胡蘿卜素和葉黃素，這也為類胡蘿卜素氧化裂解酶提供了充足底物。已有研究顯示，烏龍茶做青調(diào)控茶樹脂氧合酶[23]和單萜合成酶[24]表達(dá)，與烏龍茶香氣形成密切相關(guān)。

雖然類胡蘿卜素裂解是烏龍茶香氣形成途徑之一，但其機(jī)制還不明確，CsCCD1和CsCCD4在烏龍茶加工過程中的表達(dá)模式研究還罕有報道。本試驗以鐵觀音嫩梢為材料，克隆得到CsCCD1和CsCCD4全長cDNA序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用qRT-PCR技術(shù)檢測了CsCCD1和CsCCD4在茶樹不同組織部位和烏龍茶做青的表達(dá)模式，為明確CsCCD1和CsCCD4在烏龍茶加工過程香氣形成的作用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

鐵觀音茶樹種植于福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院教學(xué)茶山，2017年10月中旬采制以下試驗材料：

(1)采摘鐵觀音茶樹嫩梢第二葉，提取總RNA和cDNA用于后續(xù)的RT-PCR實驗。

(2)采集鐵觀音茶樹根、莖、第二葉、花和成熟果，用于檢測CsCCD1和CsCCD4組織特異性表達(dá)。

(3)采集鐵觀音茶樹中開面一芽三葉嫩梢進(jìn)行烏龍茶加工，對鮮葉、曬青、一搖、二搖、三搖和殺青前各工序在制品二葉取樣，用于檢測在烏龍茶做青過程中的表達(dá)模式。

所有試驗均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，取樣后立即用液氮冷凍隨即轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1總RNA提取和cDNA的合成按照天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取茶樹總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定濃度和純度。采用TaKaRa的PrimeScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA。

1.2.2CsCCD1和CsCCD4基因克隆CsCCD1和CsCCD4基因序列從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[25]得到，在ORF兩端設(shè)計引物(表1)進(jìn)行RT-PCR，參照TransTaq?DNA Polymerase High Fidelty (HiFi)試劑盒進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃反應(yīng)2 min，72 ℃延伸10 min，35個循環(huán)。采用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，PCR產(chǎn)物按照天根通用型DNA純化回收試劑盒回收。新鮮膠回收產(chǎn)物立即連接到pEASY-Blunt Zera Cloning載體，轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞在氨芐青霉素固體LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜，挑選3個陽性克隆菌液送至北京華大基因科技有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.3CsCCD1和CsCCD4生物信息學(xué)分析利用DNAStar軟件進(jìn)行ORF查找，使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸預(yù)測。使用ProtParam、TargetP、SingalP 4.1 Server、ChloroP軟件對編碼氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用MEME Suit 4.12.0和TMHMM server 2.0軟件進(jìn)行Motif和跨膜結(jié)構(gòu)分析。使用GOR4、SWISS-MODEL在線分析工具構(gòu)建蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)并用Pymol軟件編輯輸出。使用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4CsCCD1和CsCCD4實時熒光定量PCR表達(dá)分析在NCBI Ptimer-Blast上設(shè)計熒光定量PCR引物(表1)，采用TransStart?Tip Green qRT-PCR superMix試劑盒10 μL體系，分別以茶樹ACTIN1和EF1為內(nèi)參基因，檢測CsCCD1和CsCCD4在鐵觀音茶樹組織部位、烏龍茶做青過程中的表達(dá)量。實驗結(jié)果利用Excel 2016按照2-ΔΔCt方法進(jìn)行計算，SPSS 21.0軟件進(jìn)行ANOVA分析，利用GraphPad Prism 6繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCCD1和CsCCD4基因克隆

1．CsCCD1；2．CsCCD4 圖1 CsCCD1和CsCCD4基因全長擴(kuò)增Fig.1 The full length amplification of CsCCD1 and CsCCD4

通過RT-PCR技術(shù)得到基因全長cDNA(圖1)，序列拼接結(jié)果通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)具有完整ORF，與其他物種CCD1和CCD4具有高度相似性，命名為CsCCD1和CsCCD4 (NCBI登錄號分別為MH119136和MH119137)。CsCCD1序列全長1 766 bp，包含1 641 bp ORF，編碼545個氨基酸。CsCCD4序列全長1 942 bp，包含1 842 bp ORF，編碼612個氨基酸。

2.2 CsCCD1和CsCCD4蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測和結(jié)構(gòu)分析

理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果顯示，CsCCD1相對分子量為61.62 kD，理論等電點為5.74, 不穩(wěn)定系數(shù)30.03，平均親水系數(shù)-0.250，推測為穩(wěn)定的親水蛋白。CsCCD4相對分子量為66.75 kD，理論等電點為5.99，不穩(wěn)定系數(shù)41.70，平均親水系數(shù)-0.186，推測為不穩(wěn)定的親水蛋白。

TMHMM server 2.0、TargetP、SingalP4.1 Server、ChloroP在線分析軟件顯示，CsCCD1和CsCCD4不具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽序列，屬于非分泌蛋白。CsCCD1位于細(xì)胞質(zhì)中，CsCCD4定位于葉綠體上。葉綠體轉(zhuǎn)運肽預(yù)測結(jié)果顯示CsCCD1不存在N端葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列，而CsCCD4在N端存在42個氨基酸殘基的葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列，與前人研究結(jié)果一致[28-29]。

GOR4預(yù)測編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，CsCCD1的α-螺旋占27.47%，延伸鏈占22.89%，無規(guī)則卷曲占49.63%。CsCCD4的α-螺旋占21.37%，延伸鏈占17.29%，無規(guī)則卷曲占61.34%。用PyMOL軟件編輯輸出蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)(圖2)，CsCCD1和CsCCD4均與玉米VP14蛋白(3npe.1.A)相似性最高，分別達(dá)到39.92%和39.88%，GMQE分值為0.71和0.64。

2.3 CsCCD1和CsCCD4蛋白質(zhì)同源比對和進(jìn)化樹分析

同源性和保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，CsCCD1和CsCCD4序列具有CCD家族保守結(jié)構(gòu)域RPE65。CsCCD1與杜鵑RjCCD1(BAT32878.1)相似度為88%。CsCCD4與杜鵑RjCCD4(BAT32880.1)相似度達(dá)到76%。

利用DNAMAN軟件與其他植物中的CCD蛋白進(jìn)行多序列比對，結(jié)果顯示(圖3，A、C)，茶樹CsCCD1和CsCCD4同其他物種具有較高的保守性，已有研究結(jié)果表明通過4個嚴(yán)格保守的組氨酸Fe2+活性位點發(fā)揮作用[30]。其中CsCCD4還包括了特有的谷氨酸和天冬氨酸位點，用來固定結(jié)合Fe2+[31-32]。MEME保守結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示(圖3，B、D)，CsCCD1和CsCCD4中含有5個主要的motif，貫穿整個RPE65。利用茶樹CsCCD1和CsCCD4蛋白序列同其他物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析表明(圖4)，CsCCD1和CsCCD4均與杜鵑聚在一起，說明茶樹與杜鵑親緣關(guān)系最近。

2.4 CsCCD1和CsCCD4基因的表達(dá)分析

茶樹CsCCD1和CsCCD4在根、莖、葉、花、果實中均有表達(dá)(圖5，A)，但差異巨大，并且表達(dá)模式是相似的。在莖、葉和花中表達(dá)量較高，其中在葉中表達(dá)量最高。整體來看，CsCCD1不同組織部位中的表達(dá)水平為葉>花>莖>果>根，CsCCD4為葉>莖>花>果>根。

4個嚴(yán)格保守的Fe2+活性位點用綠色表示，谷氨酸和天冬氨酸固定位點用藍(lán)色表示，紅色為CCD蛋白特征保守結(jié)構(gòu)域序列圖2 CsCCD1(A)和CsCCD4(B)蛋白三維結(jié)構(gòu)Four strictly conserved iron-coordinating residues in green. Glutamates or aspartates fixing in blue. The conserved domain of CCD protein in red. Fig.2 Three-dimensional structure analysis of CsCCD1 (A) and CsCCD4 (B) proteins

圖4 CsCCD1和CsCCD4系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of CsCCD1 and CsCCD4

CsCCD1、CsCCD4.茶樹；RjCCD1、RjCCD4. 杜鵑(BAT32878.1、BAT32880.1)；CmCCD1.筍瓜(XP_022991870.1)；VvCCD1.葡萄(AFJ94677.1)；PhCCD4.矮牽牛(BBB22187.1)；LbCCD4.枸杞(AIX87510.1); 方框中為葉綠體轉(zhuǎn)運肽，下劃線表示CCD家族保守結(jié)構(gòu)域，*表示4個保守的Fe2+活性位點，△表示谷氨酸和天冬氨酸固定位點圖3 多序列比對(A、C)和MEME保守域預(yù)測(B、D)CsCCD1, CsCCD4.Camellia sinensis; RjCCD1, RjCCD4.Rhododendron japonicum;CmCCD1.Cucurbita maxima; VvCCD1.Vitis vinifera; PhCCD4. Petunia hybrida;LbCCD4. Lycium barbarum; A putative chloroplast-targeting transit peptide is framed, the conserved domain of CCD protein is underlined, * expression four strictly conserved iron-coordinating residues, △expression Glutamates or aspartates fixingFig.3 Multiple alignment(A，C) and motif prediction(B，D) analysis using MEME database

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著；1.鮮葉；2.曬青；3.一搖；4.二搖；5.三搖；6.殺青前圖5 CsCCD1和CsCCD4的表達(dá)分析Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level. 1. Leaves；2. Solar withering；3. First tumbling；4. Second tumbling；5. Third tumbling；6. Before fixationFig.5 Expression analysis of CsCCD1 and CsCCD4

烏龍茶加工包括了6個階段，首先將鮮葉放置水篩在室外曬青30 min，茶樹CsCCD1和CsCCD4表達(dá)模式一致(圖5，B)，從鮮葉到曬青下調(diào)表達(dá)，CsCCD4表達(dá)量下降顯著。一搖至三搖階段，分別利用水篩每隔2 h手工搖青3、8、10 min，并在每次搖青后涼青2h取樣。在此階段中，CsCCD1和CsCCD4在一搖后迅速顯著上調(diào)達(dá)到峰值，CsCCD1表達(dá)量增加明顯。雖然從一搖后均有下降，但CsCCD1在一搖至三搖一直保持在較高水平。三搖結(jié)束后攤放5 h至殺青前，CsCCD1表達(dá)量才顯著低于鮮葉，而CsCCD4表達(dá)量在一搖后迅速下調(diào)至較低水平，顯著低于鮮葉。

3 討 論

本試驗通過同源克隆得到茶樹類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因CsCCD1和CsCCD4，其中CsCCD1的cDNA全長1 766 bp，編碼545個氨基酸。CsCCD4的cDNA全長1 942 bp，編碼612個氨基酸，系統(tǒng)發(fā)育樹分別與杜鵑RjCCD1和RjCCD4聚為一類。NCBI比對發(fā)現(xiàn)具有CCD家族RPE65特征保守結(jié)構(gòu)域，還有4個高度保守的Fe2+結(jié)合位點的組氨酸殘基。CCD作為典型的非血紅素鐵氧酶，這種四重鐵離子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更高的極性中心，促進(jìn)了底物與雙氧位點結(jié)合[33]。CsCCD1定位于細(xì)胞質(zhì)而CsCCD4則位于質(zhì)體，CsCCD4的N端葉綠體轉(zhuǎn)運肽，表明CsCCD1和CsCCD4作為類胡蘿卜素雙加氧酶在不同位點氧化裂解廣泛的類胡蘿卜素底物[13, 34]。

Wei等[35]研究表明番茄SlCCD1和SlCCD4在葉、莖和花中的表達(dá)量顯著高于其他部位，特別是SlCCD4的差異更加明顯，而菊花CmCCD4a在花器官和根中幾乎不表達(dá)[36]。Tian等[37]發(fā)現(xiàn)枸杞LcCCD4不但在葉和花中強(qiáng)烈表達(dá)，結(jié)合主要類胡蘿卜素組分分析提出LcCCD4表達(dá)水平與枸杞所含的β-胡蘿卜素濃度高度一致。本試驗中發(fā)現(xiàn)茶樹CsCCD1和CsCCD4的組織特異性表達(dá)差異顯著，在茶樹葉、莖和花的表達(dá)強(qiáng)烈。茶樹在葉片和嫩莖部位大量積累類胡蘿卜素[38]，說明基因表達(dá)與類胡蘿卜素空間分布和基因亞細(xì)胞定位關(guān)系密切，同時也有研究表明CCD1和CCD4在分子水平上調(diào)控花器官的顏色、香氣及生殖生長[36, 39-40]。

烏龍茶做青是形成天然花果香氣的關(guān)鍵，類胡蘿卜素的酶促氧化就發(fā)生在做青導(dǎo)致的半發(fā)酵過程中[17]。目前已經(jīng)報道了多種茶樹萜烯類香氣合成酶受烏龍茶做青調(diào)控，Zhou等[41]和Mei等[42]的結(jié)果說明做青的機(jī)械振動顯著提高了茶樹橙花叔醇合成酶CsNES基因和芳樟醇合成酶CsLIS表達(dá)，導(dǎo)致橙花叔醇芳樟醇大量積累，其含量變化與基因表達(dá)模式一致，形成了烏龍茶典型香氣。本研究顯示茶樹CsCCD1和CsCCD4在加工過程中表達(dá)相似，總體上看CsCCD1受做青調(diào)控更加明顯，表達(dá)水平整體高于CsCCD4。一搖的CsCCD1表達(dá)量顯著高于鮮葉和曬青葉，從三搖開始迅速降低，而CsCCD4則是在二搖后就快速降低。在酵母中表達(dá)覆盆子RiCCD1基因，可以積累β-紫羅酮和香葉基丙酮[43]。葡萄的VvCCD4基因可以裂解ζ-胡蘿卜素和番茄紅素，產(chǎn)生α-紫羅酮和香葉基丙酮等多種香氣成分[44]，并且基因表達(dá)與類胡蘿卜素前體物質(zhì)、香氣含量之間高度相關(guān)[45]。Wang等[46]利用SPME-GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，隨著烏龍茶做青程度的加重，高沸點、具有天然花果香的香氣含量大幅度提高，其中包含了多種里胡蘿卜素裂解產(chǎn)物。在烏龍茶半發(fā)酵4～8 h內(nèi)，α-紫羅酮、β-紫羅酮、香葉基丙酮和β-檸檬酸醛這些類胡蘿卜素裂解產(chǎn)物含量顯著增加，其中豐度最高的是β-紫羅酮[47]。綜上所述，烏龍茶做青調(diào)控了CsCCD1和CsCCD4表達(dá)，推測參與了烏龍茶天然花果香味的形成，較CsCCD4而言，CsCCD1對香氣形成更為重要。

目前，已經(jīng)大量研究顯示CCD1和CCD4通過降解類胡蘿卜素調(diào)控植物顏色及風(fēng)味，但在茶樹中還未有深入研究。通過類胡蘿卜素介導(dǎo)的香氣形成途徑對茶葉香氣品質(zhì)有重要作用，但其酶促降解機(jī)制還不清晰。因此，后續(xù)可以基于靶向代謝組學(xué)技術(shù)，將CsCCD1和CsCCD4基因表達(dá)與類胡蘿卜素組分及香氣組分進(jìn)行綜合分析。本研究同源克隆得到茶樹CsCCD1和CsCCD4基因，分析討論了在茶樹不同組織部位和烏龍茶加工過程中的表達(dá)模式，推測其在烏龍茶香氣形成中有重要作用，為茶樹CsCCD1和CsCCD4基因功能驗證提供理論依據(jù)。