文心蘭乙烯不敏感基因EIN2的克隆及表達分析

時 歡，李 蓉，高玉瑩，林玉玲，杜宜殷，賴鐘雄，黃鵬林,,3*

(1 福建農(nóng)林大學 園藝植物生物工程研究所，福州 350002；2 臺灣大學 園藝暨景觀學系，臺北 10617；3 中國文化大學 生物科技研究所，臺北 11114)

乙烯作為五大類激素中的唯一氣態(tài)物質(zhì)，其在植物的生長發(fā)育中扮演著重要角色，廣泛參與植物生長發(fā)育和衰老的整個生長周期，如種子的萌發(fā)，苗的生長，花的開放和衰老以及果實的成熟等[1]。乙烯主要通過一系列的信號轉(zhuǎn)導實現(xiàn)其對植物的調(diào)控過程。乙烯的受體基因是最早感受到乙烯信號的，然后它會抑制下游的CTR1，從而激活EIN2，再將信號傳遞給細胞核內(nèi)的EIN3/EILs，促進轉(zhuǎn)錄因子ERF的表達，最終誘導一系列與乙烯反應相關基因的轉(zhuǎn)錄翻譯[2]。而在乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑中EIN2是其關鍵因子。EIN2正調(diào)控乙烯反應，是一種跨膜蛋白，其N端負責接收上游信號，C端負責激活下游乙烯信號；其C端在乙烯的誘導下發(fā)生剪切，分離下來的C端就像一個轉(zhuǎn)運分子，將信號從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)郊毎藘?nèi)，完成其信號轉(zhuǎn)導的過程[3-5]。

乙烯不敏感基因最早是Alonso從擬南芥中采用圖位克隆法克隆出來的[6]。隨后從煙草[7]、蘋果[8]、桃[9]、桑樹[10]、番茄[11]、甜瓜[12]、矮牽牛[13]、石竹[14]等植物中也克隆得到了EIN2同源基因。研究發(fā)現(xiàn)AtEIN2在擬南芥的抗逆、抗病及其種子的生長發(fā)育過程起重要作用[9]。Pp-EIN2在調(diào)控桃果實成熟軟化過程中起關鍵作用[9]。在矮牽牛的發(fā)育過程中EIN2 mRNA的表達受空間和時間上的調(diào)節(jié)，且獲得花的衰老明顯延遲的轉(zhuǎn)基因植物[13, 15]。

文心蘭(Oncidesa)是世界上重要的盆切花經(jīng)濟栽培品種，具有較高的經(jīng)濟價值[16]。其離開母體，花瓣容易枯凋，所以在文心蘭切花的采收和運輸過程中極易受到損傷，內(nèi)源或外源乙烯通過信號轉(zhuǎn)導引起切花的衰老反應，而EIN2又是乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑中的關鍵因子[17]。本研究克隆了文心蘭OnEIN2基因的cDNA全長，使用qRT-PCR對文心蘭不同組織器官和不同花期中OnEIN2表達進行定量分析，以研究其生理功能、基因表達，及其在文心蘭花的衰老、乙烯信號轉(zhuǎn)導途徑中的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究材料為文心蘭‘南茜’，由福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所提供。2018年3月分別取‘南茜’的不同組織部位，包括根、假鱗莖和葉片，以及處于花苞期、綻口期、半開放期、盛開期、衰老期的花為材料進行定量表達分析。所有的材料均在液氮中凍存后存于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1文心蘭總RNA提取及其cDNA第一鏈合成參考Trizol試劑盒(Invitrogen公司)的方法提取文心蘭花器官的總RNA，以及各個部位和不同花期的RNA。采用植物基因組DNA試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)提取文心蘭‘南茜’基因組DNA。采用Thermo超微量核酸檢測儀測定RNA濃度并通過1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度和濃度，隨后采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄cDNA用于基因克隆。用PrimescriptTMRT Reagene kit試劑盒(TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于定量PCR分析。

1.2.2文心蘭OnEIN2基因的篩選與克隆從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)中下載基因AtEIN2的核酸序列作為參考序列，與‘南茜’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行比對分析，獲得一條相似度較高的cDNA序列。根據(jù)此cDNA序列設計引物(表1)OnEIN2-ORF1-F、OnEIN2-ORF1-R、OnEIN2-ORF2-F、OnEIN2-ORF2-R、OnEIN2-ORF3-F、OnEIN2-ORF3-R，以文心蘭‘南茜’的cDNA為模板進行PCR反應，擴增該基因的ORF序列。然后根據(jù)已知的ORF序列，分別設計2條3′-RACE的特異性引物和5′-RACE的特異性引物，結合GeneRacerTM3′ 和3′ 巢式引物以及5′ 和5′ 巢式引物，以‘南茜’文心蘭的cDNA為模板進行巢式PCR反應，分別擴增3′ 和5′ 序列，用DNA-MAN對所獲得的片段進行全長拼接。以上引物均由福州尚亞生物技術有限公司合成。

表1 實驗所用引物序列

PCR反應體系為25 μL，其中Dream Taq酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模版cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55～59 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。獲得的目的片段采用Gel/PCR Extraction Kit 回收，經(jīng)pMD 18-T載體連接后轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)中進行TA克隆并挑選陽性克隆子進行菌液PCR，將有目的條帶的菌液送至鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。

1.2.3生物信息學分析采用DNAMAN軟件分析核苷酸序列，通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行保守結構域預測；使用Signal P 4.0 Server預測蛋白質(zhì)信號肽；使用ExPASy Protparam預測編碼蛋白的理化性質(zhì)；使用SOPMA預測其二級結構；使用TMpred預測其跨膜結構；使用PSORT預測其定位；使用DNAMAN 6.0軟件進行引物的設計、序列拼接及序列比對，使用MEGA 6.1軟件中的Neighbor-Joining (NJ法) 進行進化樹構建。

1.2.4qRT-PCR分析本研究以Actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。根據(jù)獲得的基因序列設計1對特異引物OnEIN2-qRT-F和OnEIN2-qRT-R，采用羅氏LightCycler 480儀器，通過qRT-PCR檢測OnEIN2基因在文心蘭不同組織部位以及不同花期的表達情況。將cDNA樣本混合物進行2倍梯度稀釋，分別對目標基因和內(nèi)參基因進行擴增，獲得標準曲線、溶解曲線和擴增曲線以確定引物特異性和擴增效率。以不同組織部位及不同開放時期花器官的cDNA原液為模板進行擴增。采用SYBR premix Ex TaqTMⅡkit(TaKaRa)進行qRT-PCR反應，反應體系為20 μL，包含10 μL SYBRⅡ，1 μL cDNA模版，上下游引物各0.8 μL，7.4 μL sdH2O。程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40次循環(huán)。用 2-ΔΔCT法獲得OnEIN2的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 文心蘭OnEIN2基因的克隆

根據(jù)篩選獲得的cDNA序列，設計OnEIN2-ORF1-F、OnEIN2-ORF1-R、OnEIN2-ORF2-F、OnEIN2-ORF2-R、OnEIN2-ORF3-F、OnEIN2-ORF3-R等6條引物， PCR擴增OnEIN2基因保守區(qū) (圖1)，測序結果顯示其中ORF1長1 469 bp，ORF2長1 494 bp，ORF3長1 105 bp，拼接后得到一條3 745 bp片段。初步推測該產(chǎn)物可能為目標ORF序列。在拼接得到的序列的5′和3′分別設計特異性引物，3′ 設計OnEIN2-3P和OnEIN2-3NP為特異引物，經(jīng)3′-RACE巢式PCR擴增，電泳檢測獲得1條約650 bp條帶 (圖1)；以OnEIN2-5P和OnEIN2-5NP為特異引物，經(jīng)5′-RACE擴增，電泳檢測顯示獲得1條約200 bp條帶 (圖1)。測序結果表明，這2個片段分別為667 bp和222 bp。將獲得的5′-RACE末端、3′-RACE末端和ORF片段進行序列比對拼接，初步推斷拼接的cDNA全長為文心蘭EIN2基因序列。設計ORF全長驗證引物進行PCR擴增，比對結果顯示和拼接得到的序列一致，故此為文心蘭OnEIN2基因序列。此cDNA全長為4 177 bp，包含3 879 bp開放閱讀框，編碼1 292個氨基酸，其5′-UTR長90 bp，3′-UTR長208 bp。

2.2 文心蘭OnEIN2基因的生物信息學分析

利用Protparam分析OnEIN2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，結果顯示，該蛋白分子式C6406H9988N1670O1897S47，分子量為142.22 kD，等電點為5.80，親水性系數(shù)(GRAVY)為0.047，推測其疏水性大于親水性，不穩(wěn)定指數(shù)為45.16，屬于不穩(wěn)定蛋白。Signal P 4.1 Server信號肽預測結果表明OnEIN2不含信號肽結構，屬于非分泌蛋白。PSORT預測OnEIN2定位在質(zhì)膜中的可能性為80.0%，定位在葉綠體類囊體膜的可能性為60.9%，定位在高爾基體中的可能性為 40.0%，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的可能性為30.0%。SOPMA分析結果預測，OnEIN2蛋白二級結構主要由α螺旋(36.38%)、隨機卷曲(48.07%)、延伸鏈(12.77%)和少量的β轉(zhuǎn)角(2.79%)組成。α螺旋和隨機卷曲為二級結構的主要元件，分散于整個蛋白質(zhì)中。對文心蘭OnEIN2蛋白保守結構域進行預測，結果如圖2，該蛋白含有Nramp超家族特有的二價金屬陽離子轉(zhuǎn)運蛋白，是一種與擬南芥乙烯不敏感蛋白相似的天然抗性相關巨噬細胞家族蛋白，它是乙烯調(diào)節(jié)的信號傳導通路的中心因素。

OnEIN2的N末端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，當接收上游元件傳遞的乙烯信號后，其CNED區(qū)被切割下來，在NLS的作用下進入細胞核，并將信號傳遞給下游接受信號的元件[18-19]。經(jīng)過Smart在線軟件分析，編碼序列中第5 ～ 451位氨基酸含有11個跨膜結構，其中第33 ～ 368個氨基酸區(qū)域為類Nramp蛋白結構域(圖3)。經(jīng)過序列比對分析，預測第631和632個氨基酸之間為信號切割點，第631個氨基酸以后的序列為CNED區(qū)；L1261 ～ L1268的序列被預測為核定位信號(NLS)[10]。

2.3 OnEIN2進化樹分析與氨基酸序列比對

分析文心蘭OnEIN2基因與鐵皮石斛、擬南芥、水稻等植物的EIN2基因編碼氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)文心蘭與鐵皮石斛、小蘭嶼蝴蝶蘭、小果野芭蕉、海棗等物種進化距離較近，且這些進化關系近的植物的氨基酸序列比對結果顯示其一致性為72.25%，其保守性較高。以文心蘭與其他物種的EIN2基因編碼氨基酸序列比對為基礎，構建NJ進化樹，以分析它們的進化關系。參照進化樹的構型，可將整個進化樹劃為2個亞群(圖4)。其中I類除了香石竹外均是單子葉植物；Ⅱ類除了玉米、水稻外均是雙子葉植物。說明雙子葉植物和單子葉植物的乙烯信號轉(zhuǎn)導在進化上可能存在一定差異[10]。

2.4 OnEIN2在文心蘭不同組織器官中的表達分析

以Actin為內(nèi)參基因，分析了OnEIN2在文心蘭不同器官定量表達模式。qRT-PCR結果(圖5)表明，OnEIN2在文心蘭的根、假鱗莖、葉和花中均有表達，其中假鱗莖中的表達量最低；花中的表達量最高，花中的表達量約為假鱗莖中的28倍；OnEIN2在葉中的表達量高于根中的，但都低于花；而其在根中的表達量也僅略高于假鱗莖中的表達量。由此可以推斷出，文心蘭花的生長發(fā)育過程或與OnEIN2有關。

圖2 文心蘭OnEIN2保守結構域的預測結果Fig.2 Prediction of OnEIN2 conserved domains

OnEIN2：文心蘭；DeEIN2：鐵皮石斛；ElaEIN2：油棕；AtEIN2：擬南芥圖3 文心蘭OnEIN2編碼蛋白分析OnEIN2：Oncidesa；DeEIN2：Dendrobium catenatum；ElaEIN2：Elaeis guineensis；AtEIN2：Arabidopsis thalianaFig.3 Analysis of OnEIN2 predicted protein

節(jié)點上的數(shù)值表示bootstrap重復1 000次的置信度，括號內(nèi)為蛋白登錄號圖4 文心蘭與不同植物中EIN2系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree comparing the EIN2 nucleotide sequences of different plants

圖5 文心蘭不同組織部位的OnEIN2基因表達Fig.5 Expression analysis of OnEIN2 in different tissues of Oncidesa

圖6 文心蘭不同花期的OnEIN2基因表達Fig.6 Expression analysis of OnEIN2 in different flowering stages of Oncidesa

2. 5 OnEIN2在文心蘭不同花期中的表達分析

文心蘭不同花期的定量結果表明，OnEIN2基因隨著花的開放呈現(xiàn)上升的趨勢，呈現(xiàn)一定的規(guī)律性(圖6)。從花苞期到半開放期，OnEIN2基因的表達量變化不明顯，而從半開放期到盛開期，相對表達量持續(xù)增加，并在盛開期到達最高表達量，接著從盛開期到衰老期的表達量呈下降趨勢。盛開期的表達量約為花苞期的2.27倍。從定量圖中可以看出，該基因的表達具有明顯的時間特異性。

3 討 論

3.1 文心蘭OnEIN2蛋白特性分析

采用RT-PCR結合RACE法，從文心蘭‘南茜’中克隆獲得長為4 177 bp的OnEIN2基因，其中ORF長為3 879 bp，預測可編碼1 292個氨基酸。對其分析發(fā)現(xiàn)該蛋白N端是個Nramp家族，C端含有C-NED和一個核定位信號。EIN2是乙烯信號傳遞途徑中的一個重要組分，它介導了蛋白激酶CTRI和轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL之間的信號傳遞，是乙烯和脅迫反應共有的一個雙功能蛋白質(zhì)。而且EIN2連接了不同的激素信號途徑，植物可能擁有一個組合機制通過啟用一套共有的信號傳遞分子來調(diào)節(jié)不同的脅迫[15]。EIN2 基因的表達對于植物營養(yǎng)生長、成熟衰老和脅迫響應也有重要意義[6, 13]。此外，當EIN2功能缺失時，植物體對乙烯不敏感[6]。

3.2 OnEIN2可能在文心蘭花的盛開和衰老過程中發(fā)揮著重要作用

本研究的qPCR結果表明OnEIN2在不同的組織部位中的相對表達量差異顯著，依次為花>葉>根>假鱗莖，其中在花中的表達量遠遠大于其他3個組織部位，說明該基因在花的整個發(fā)育過程中起重要作用；而在不同花期中的定量結果顯示其在盛花期相對表達量最高，而后是衰老期，而花苞期、綻口期和半開放期的表達量相似。OnEIN2基因的時空表達特異性表達說明它與花衰老有很大關系。因為有乙烯存在時會激活受體基因，進而激活EIN2，所以當EIN2的表達量高時，說明此時乙烯含量比較高，這也是引起其花衰老的一個重要原因。用外源乙烯(10 μL/L)處理切花香石竹，DcEIN2在花瓣中第12～24 h表達量有所增加[14]。Shibuya等[13]通過共抑制和RNAi的方法獲得PhEIN2基因表達水平低的轉(zhuǎn)基因植株，其花的衰老明顯延遲，不定根的生成受到抑制，由此可見EIN2在植物生長發(fā)育和乙烯的反應中有重要作用。

不同植物中EIN2基因的發(fā)揮的作用不盡相同。EIN2 基因的表達量在鹽脅迫作用下會被下調(diào)，ein2 擬南芥突變體在鹽脅迫作用下生長受到的抑制要比野生型更顯著，表明EIN2參與了植物的脅迫響應途徑，其表達量的降低可能是植物適應脅迫的表現(xiàn)[20-21]。甜瓜Cm-EIN2在幼葉和花瓣組織中的表達量相似,約為根中表達量的2倍，莖中表達最低，子房中最高[12]，說明EIN2參與了植物的營養(yǎng)生長。LeEIN2基因被抑制的植株其果實成熟明顯延長[22]。Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)LeEIN2基因下調(diào)的番茄植株的果實表現(xiàn)為成熟抑制。在桃的花蕾期到盛花期Pp-EIN2基因的表達量一直都在上升；在采收后，隨著果實的成熟軟化，Pp-EIN2的表達量和乙烯的釋放速率的變化表現(xiàn)出相同的趨勢，說明EIN2基因影響果實的成熟發(fā)育過程[9]。智軍海等[24]研究表明桃花完成授粉受精以后PpEIN2基因的表達量明顯高于其在花蕾期和盛花期的表達量，且當果實和種仁中乙烯達到最大釋放量時，PpEIN2表達量也相應的表現(xiàn)出一個明顯地高峰。據(jù)此推測EIN2與果實發(fā)育和成熟密切相關。本研究為后續(xù)進一步研究文心蘭EIN2蛋白的功能及其和花的衰老之間的聯(lián)系提供一定的依據(jù)。后續(xù)可以通過轉(zhuǎn)基因或其他方法抑制該基因的表達進而使花形成對乙烯的不敏感，這還有待進一步的實驗證明。