羊草DHN3基因的克隆及其逆境響應的表達分析

萬永青，張 杰，侯向陽，王照蘭，馬玉寶，萬其號，萬東莉*

(1 中國農業(yè)科學院 草原研究所，農業(yè)部草地生態(tài)與修復治理重點實驗室，呼和浩特 010010；2 內蒙古農業(yè)大學 生命科學學院， 內蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學重點實驗室，呼和浩特 010011)

植物在其生長的自然環(huán)境中不斷地遭受各種生物和非生物逆境脅迫，為了在這樣的條件下生存，植物進化出復雜的機制來感知外部信號，從而對環(huán)境刺激做出最佳的響應[1]。脫水素(dehydrins, DHNs)是2組LEA亞家族蛋白，其表達在種子發(fā)育后期大量積累，并且受缺水、鹽、低溫和ABA等不同逆境脅迫處理的誘導[2]。脫水素的表達能增加植物對低溫、脫水、干旱、鹽和滲透等脅迫的忍耐性[3-8]。脫水素最初在棉花發(fā)育的胚胎中被鑒定為“D-11”家族蛋白[9]。脫水素蛋白高度親水，含有高比例的帶電極性氨基酸和低比例的疏水性、非極性殘基，且缺乏色氨酸和半胱氨酸殘基[9]。根據(jù)保守序列Y-、S-和K-片段的包含方式，脫水素被分為五種類型：Kn、SKn、KnS、YnKn和YnSKn[4, 10]。其中K-片段(EKKGIMDKIKEKLPG或類似的序列)存在于所有的脫水素中，是一段高度保守的、賴氨酸富集的序列，與A2親水性α-螺旋形成以及與一些大分子結合有關，位于接近于脫水素蛋白C末端的位置，每個脫水素含有一個或多個獨特的K-片段[10-13]。Y-片段(V/TDEYGNP或類似的序列)與分子伴侶的核苷酸結合位點有部分相似性，位于接近于脫水素蛋白N末端的位置，一般有1～3個拷貝[8, 10]。S-片段(LHRSGSSSSSSSEDD 或相關的序列)是磷酸化位點，主要由5～7個連續(xù)的色氨酸殘基和緊隨其后的3個氨基酸組成[8, 11]。

羊草(Leymuschinensis(Trin.) Tzvel)隸屬禾本科小麥族(TriticeaeDumort.)賴草屬(LeymusHochst.)，是歐亞大陸草原區(qū)東部草甸草原及典型草原上的重要建群種之一，在蒙古、俄羅斯和哈薩克斯坦以及中國的東北三省、內蒙古和新疆等省區(qū)廣泛分布[14]。羊草具有極強的環(huán)境適應性，如極端溫度、干旱和高鹽堿[15]。近幾年關于羊草抗逆基因的研究逐漸增多，如LcMYB1[16]、LcSAIN1[17]和LcSAIN2[18]提高了轉基因擬南芥的耐鹽性，LcFIN1[19]和LcWRKY5[20]分別提高了轉基因擬南芥對冷和干旱的耐受能力，LcSAMDC1能同時提高轉基因擬南芥對冷和鹽的耐受性[21]。此外，MADS-box家族基因參與了羊草對非生物逆境脅迫的響應[22]。

本研究通過對羊草轉錄組數(shù)據(jù)中篩選獲得的1個LcDHN3基因進行了克隆，對該基因及其蛋白編碼序列進行生物信息學分析，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)對不同逆境脅迫下LcDHN3基因的表達特性進行研究，為進一步開展LcDHN3參與逆境脅迫響應的功能研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與脅迫處理

將羊草“吉生4號”種子播種于裝有蛭石和營養(yǎng)土(2∶1)的培養(yǎng)缽中，置于16 h光照/8 h黑暗、溫度為23～25 ℃的溫室培養(yǎng)。生長30 d后選取長勢一致的羊草用于不同的脅迫處理。

干旱、鹽、高pH、ABA和JA處理：將羊草植株從培養(yǎng)缽中取出并用清水清洗干凈，將小苗置于濾紙進行干旱處理，將小苗根部分別浸泡在300 mmol/L NaCl溶液、200 mmol/L碳酸氫鈉溶液(pH 10)、100 μmol/L ABA水溶液和100 μmol/L JA水溶液中進行鹽、高pH、ABA和JA處理[23-25]。

冷、熱和機械損傷處理：將羊草植株連同培養(yǎng)缽分別置于4 ℃和42 ℃培養(yǎng)箱中進行冷和熱處理；將培養(yǎng)缽中羊草植株的每個葉片采用0.45 mm×15.5 mm的無菌針頭穿刺3孔進行機械損傷處理。

在處理的不同時間點(0.5、1、3、6、12、24和48 h)取樣，以0 h未處理樣品作為對照。每個處理時間點取3株植物地上組織混合并迅速放入液氮速凍，于-80 ℃冰箱保存作為后續(xù)檢測的樣品。共進行3次生物學重復實驗。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成按照植物RNA提取試劑盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)的說明提取羊草地上組織總RNA。按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)的步驟進行cDNA的合成。

1.2.2LcDHN3基因克隆將羊草轉錄組中篩選到的LcDHN3序列，通過NCBI的Blastx進行比對，采用DNAMAN7軟件分析獲得LcDHN3的ORF序列及其推導的氨基酸序列。

采用軟件Primer Premier 5.0，設計LcDHN3基因的全長擴增引物LcDHN3-F/LcDHN3-R(表1)。以羊草cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增體系為：5×PrimeSTAR?緩沖液 10 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O 32.5 μL。擴增程序為：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃補充延伸5 min，16 ℃保存。目的PCR產物經凝膠回收試劑盒(天根)回收后，與pEASY-BluntSimple載體(全式金)連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，通過藍白斑篩選后利用M13引物進行菌落PCR驗證，將陽性克隆進行測序驗證。

表1 引物序列

1.2.3序列生物信息學分析利用NCBI CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線預測LcDHN3的保守結構域。

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫的在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測分析LcDHN3蛋白的等電點、分子質量、不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)、脂肪系數(shù)(aliphatic index)、平均親水系數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)和各氨基酸的組成等。利用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_ automat.pl?page=npsa_gor4.html)預測分析LcDHN3蛋白的二級結構。通過PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)，采用k-NN(k-nearest neighbor)算法，預測LcDHN3蛋白的亞細胞定位。

利用NCBI blastp進行在線比對分析，挑選出相似性較高的同源蛋白序列，利用DNAMAN7進行多重序列比對，結合PROSITE(https://prosite.expasy.org/)分析保守區(qū)域序列和基序。同時，從Blastp比對結果中挑取不同物種的同源序列。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的同源序列分別從基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.medicagogenome.org/)和TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中獲得。運用MEGA6軟件進行序列比對分析，采用鄰近法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4LcDHN3基因表達分析通過qRT-PCR技術對不同逆境脅迫處理下目的基因的表達量進行檢測。利用羅氏 LightCycler 480 Real-Time PCR System，TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進行qRT-PCR反應，具體參考方法[26]。以羊草LcActin為內參基因，采用2-ΔΔCT方法對LcDHN3基因的相對表達量進行分析。引物序列詳見表1。

2 結果與分析

2.1 LcDHN3基因克隆與保守結構域分析

以羊草的cDNA為模板，根據(jù)轉錄組獲得的羊草DHN3序列設計基因特異引物，PCR擴增獲得的LcDHN3基因片段，經過測序驗證，利用NCBI blastx進行比對分析，結果顯示該基因具有完整的ORF，全長為501 bp(圖1)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，編碼167 aa，在GenBank的登錄號為MH551243。

利用NCBI CDD分析顯示，LcDHN3具有Dehydrin superfamily保守結構域(圖2)。通過NCBI blastp比對結果顯示LcDHN3與其他植物的DHNs具有較高相似性，其中與大麥(Hordeumvulgare)的DHN3相似性最高，為92%。與同屬于禾本科植物小麥(Triticumaestivum)的salt-induced YSK2 dehydrin 2、長穗偃麥草(Thinopyrumelongatum)的dehydrin-/LEA group 2-like protein、粗山羊草(Aegilopstauschii)的dehydrin DHN3-like、 冰草(Agropyroncristatum)的drought acclimation dehydrin WZY2和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的dehydrin DHN3比對的相似性分別為88%、84%、83%、91%和73%。

M.DL2000；1～4.LcDHN3 ORF圖1 PCR克隆LcDHN3基因Fig.1 PCR cloning of LcDHN3 gene

圖2 LcDHN3蛋白功能位點分析Fig.2 Conserved domain analysis of LcDHN3 protein

A. LcDHN3;B.長穗偃麥草(AAC05922.1);C. 大麥(ALL25871.1);D. 粗山羊草(XP_020188299.1);E. 冰草(AEJ88293.1);F. 普通小麥(AOM63238.1);G. 二穗短柄草(XP_010227582.1); 粉色箭頭代表Y-片段，紅色箭頭代表S-片段，紅色線段代表K-片段圖3 LcDHN3與其他物種DHNs同源比對A. LcDHN3; B.Thinopyrum elongatum (AAC05922.1); C. Hordeum vulgare (ALL25871.1); D. Aegilops tauschii (XP_020188299.1); E. Agropyron cristatum (AEJ88293.1); F. Triticum aestivum (AOM63238.1); G. Brachypodium distachyon (XP_010227582.1); Pink arrow represents Y-segment, red arrow represents S-segment, red lines represent K-segmentsFig.3 Multiple alignment of LcDHN3 and homology sequences from other plants

2.2 LcDHN3蛋白理化特性分析

用在線軟件ProtParam預測分析結果顯示，LcDHN3分子量17.01 kD，理論等電點為8.05，氨基酸序列的分子式為C703H1120N234O248S6；LcDHN3蛋白的氨基酸組成中，不包含色氨酸和半胱氨酸，其中甘氨酸所占的比例最高為25.1%，苯丙氨酸所占的比例最低為0.6%。親疏水性分析顯示LcDHN3蛋白的總平均疏水指數(shù)小于0，為-1.085，表明屬于親水性蛋白。脂肪系數(shù)為33.35，不穩(wěn)定指數(shù)為21.45，低于40，因此認為LcDHN3是穩(wěn)定的蛋白質[27]。

GOR4在線工具預測結果顯示，LcDHN3蛋白含有3種結構：其中無規(guī)則卷曲比例最多為59.28%，其次為延伸鏈比例為24.55%，α螺旋的比例最少為16.17%。通過PSORT對LcDHN3蛋白的亞細胞定位進行預測，結果顯示LcDHN3在不同亞細胞定位的k-NN指數(shù)分別為：細胞質39.1%，細胞核34.8%，線粒體21.7%，高爾基體4.3%；NNCN(Reinhardt’s method)[28]預測結果為LcDHN3定位于細胞質，因此推測LcDHN3優(yōu)先定位于細胞質和細胞核。

2.3 LcDHN3同源比較和系統(tǒng)進化分析

圖3顯示，LcDHN3與其他植物的DHNs氨基酸序列的整體相似性為84.27%。進一步結合PROSITE對LcDHN3的保守基序進行分析，結果顯示LcDHN3含有1個Y-片段(位于N 端)、1個S-片段和2個K-片段(位于C端)(圖3)。

聚類分析結果(圖4)顯示，LcDHN3蛋白與大麥的DHN蛋白聚為一個小的分支，然后與長穗偃麥草和粗山羊草的DHNs共同聚在一個較大的分支，表明LcDHN3蛋白與大麥的DHN親緣關系最近，其次為長穗偃麥草和粗山羊草的DHNs，而與蒺藜苜蓿和擬南芥的DHNs關系較遠。

進化樹采用鄰近法構建，Bootstrap值設為1 000次圖4 LcDHN3的系統(tǒng)進化樹The phylogenetic tree is constructed using the neighbor joining method, Bootstrap values based on 1 000 replications.Fig.4 The phylogenetic tree of LcDHN3

圖5 不同逆境脅迫下LcDHN3的表達Fig.5 The expression patterns of LcDHN3 under different stress treatments

2.4 逆境脅迫下LcDHN3的表達分析

2.4.1非生物逆境脅迫下LcDHN3的表達圖5表明，不同逆境脅迫處理均能強烈誘導LcDHN3基因表達。干旱和冷脅迫下，LcDHN3基因在處理3 h開始被誘導表達，12 h達到峰值，分別是對照的152和7倍。在NaCl脅迫下，LcDHN3基因在處理0.5 h被誘導表達，在24 h表達量達到最高，是對照的34倍。在熱脅迫下，LcDHN3基因表達在處理1 h被誘導表達，隨著處理時間呈遞增趨勢，在48 h時表達量最高為對照的121倍。高pH(10)處理下，LcDHN3基因表達在0.5 h開始被誘導表達，在3 h表達量達到峰值并持續(xù)到6 h，是對照的18倍，之后表達量開始下降，但是在處理48 h時，表達量又開始增加，達到對照的15倍。機械損傷脅迫0.5 h后，LcDHN3基因表達被迅速誘導，并在1 h時達到峰值，是對照的56倍。

圖6 ABA和JA處理下LcDHN3的表達Fig.6 The expression patterns of LcDHN3 under ABA and JA treatments

2.4.2相關激素脅迫下LcDHN3的表達圖6顯示，LcDHN3基因表達被ABA處理強烈誘導，在處理0.5 h時被誘導表達，是對照的2倍，在48 h達到峰值，是對照的54倍。同時，LcDHN3基因表達也受JA誘導，在處理1 h時被誘導表達，6 h時達到峰值，是對照的16倍。

3 討 論

脫水素是研究最廣、最具有特征的一類LEA蛋白[2]，存在于已經研究的所有高等植物中[13]，在大麥[29]、擬南芥[30]和水稻[31]中分別鑒定了13、10和8個DHNs。此外，DHNs也存在于藻類植物、苔蘚類植物、酵母和藍細菌等生物中[13, 32-33]。

本研究從羊草中克隆得到一個LcDHN3基因。通過同源蛋白序列比對顯示其與大麥等6種植物同源序列的整體相似性為84.27%，表明具有較高的保守性。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示LcDHN3與大麥的DHN親緣關系最近，同時和長穗偃麥草和粗山羊草的DHN親緣關系也較近。脫水素最顯著的特征就是所有的DHN都含有至少一個拷貝的、保守的K-片段[33]，保守基序分析顯示LcDHN3含有2個K-片段(RKKGIKEKIKEKLPG和EKKGIMDRIKEKLPG)，1個Y-片段(VDEYGNP)和1個S-片段(LQRSGSSSSSSSEDD)，因此為YSK2型脫水素。理化特性分析顯示LcDHN3是親水蛋白，不含有色氨酸和半胱氨酸，這與脫水素所具有的特性一致[9]。

研究表明，DHN蛋白在植物生長發(fā)育過程中分布于不同的組織，亞細胞定位于不同的細胞器，包括細胞質、細胞核、質膜、線粒體和液泡，但是主要定位于細胞質和細胞核[33]。例如，玉米ABA響應蛋白rab17是一個YSK2型脫水素，亞細胞定位于細胞核和細胞質[34]。本研究通過NNCN(Reinhardt's方法根據(jù)氨基酸組成來判斷細胞核或細胞質的傾向)分析LcDHN3優(yōu)先定位于細胞質，同時在LcDHN3蛋白序列中預測到了一個YnSKn型脫水素特有的核定位信號“RRKK”，且擁有與核定位有關的S-片段[33]，結合K-NN指數(shù)(細胞質39.1%，細胞核34.8%)，推測LcDHN3可能同時定位于細胞質和細胞核。

脫水素在參與植物對逆境脅迫響應的信號途徑中具有重要作用。例如，番茄(Solanumhabrochaites)的1個SK3型脫水素基因ShDHN在根、莖、葉、花和果實中具有組成型表達，同時在番茄耐冷品種(S.habrochaites)中的表達高于易感品種(S.lycopersicum)[3]。此外，ShDHN的表達受干旱、鹽和滲透脅迫調節(jié)，過量表達ShDHN后增加了番茄耐受冷和干旱脅迫的能力，與野生型相比，轉基因植物積累了脯氨酸，維持了超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的較高酶活性，減少了膜的損傷[3]。在大麥和普通小麥中大多數(shù)的脫水素都屬于YnSKn型，并且基因的表達受脫水脅迫(干旱、鹽和霜)和ABA處理等的誘導[35]。黃瓜(Cucumissativus)CsLEA11蛋白是一個Y3SK2型脫水素，CsLEA11基因的轉錄受熱和冷脅迫的顯著誘導，在大腸桿菌中過量表達CsLEA11后能增強細胞的活力和對冷和熱的耐受能力[36]。此外，CsLEA11蛋白可在高溫脅迫下保護乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase)的活性[36]。高粱YSK2型脫水素基因SbDhn1的表達受高溫和滲透脅迫的誘導，在煙草中過量表達SbDhn1后，轉基因株系通過減少膜損傷和降低MDA含量，提高對逆境脅迫的耐受能力[37]。本研究中，YSK2型脫水素LcDHN3的表達受不同非生物逆境脅迫(干旱、鹽、冷、熱、高pH和機械損傷)以及植物激素ABA和MeJA的強烈誘導，表明LcDHN3參與了羊草對非生物逆境脅迫的響應，預示其在羊草響應非生物逆境脅迫中具有重要作用。但是LcDHN3在非生物逆境脅迫響應信號途徑中如何作用以及處于什么位置還不清楚，亟待展開進一步的研究對其功能進行驗證。