基于氣質(zhì)聯(lián)用法的兩種香型白酒揮發(fā)性成分差異分析

楊 亮，占楊楊，魏 剛，陳守文，馬 昕*

（1.茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州 仁懷 564501；2.湖北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；3.茅臺(tái)學(xué)院 食品工程系，貴州 仁懷 564501）

中國白酒歷史悠久，釀造工藝精湛。作為世界蒸餾酒產(chǎn)量及消費(fèi)量最大的國家[1]，我國2016年白酒（折65%vol）總產(chǎn)量及消費(fèi)量分別為135.84億L及135.70億L[2]。我國現(xiàn)已認(rèn)證的白酒香型有13種，其中醬、濃、清、米為四大基本香型，其余香型為在此基礎(chǔ)上衍生出來的新香型[3-4]。醬、濃香型白酒分別占據(jù)白酒行業(yè)利潤第一及市場(chǎng)占有第一。

白酒中水和乙醇約占98%，香味物質(zhì)只占2%左右，而白酒的香型、風(fēng)格和品質(zhì)卻取決于這僅占2%的香味物質(zhì)的成分、含量及其量比關(guān)系[5]。隨著人們對(duì)白酒健康、品質(zhì)等方面要求的提高，酒類相關(guān)研究也逐步拓展，現(xiàn)主要集中在白酒保健、白酒風(fēng)味組學(xué)、白酒安全等領(lǐng)域[6-8]。白酒相關(guān)領(lǐng)域研究多以醬香和濃香中的一種作為研究對(duì)象[9-11]，極少關(guān)于對(duì)這兩種香型進(jìn)行比較分析的報(bào)道，也僅檢測(cè)了單一品牌不同香型白酒組分差異或?qū)Σ煌阈瓦M(jìn)行了初步的成分聚類[12-13]。將不同流派、風(fēng)格的兩種香型白酒進(jìn)行主成分分析后，再進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)差異分析的研究少見報(bào)道，醬、濃香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)的區(qū)別，至今沒有準(zhǔn)確、全面的表述。

本研究旨在用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gaschromatographymass spectrometry，GC-MS）技術(shù)通過直接進(jìn)樣分析不同風(fēng)格和流派的醬、濃香型白酒的揮發(fā)性物質(zhì)。在主成分分析（principal component analysis，PCA）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究不同香型白酒間揮發(fā)性物質(zhì)差異，討論釀造工藝與組分間的關(guān)系，從而深入了解白酒香型、流派、揮發(fā)性物質(zhì)及釀造工藝間的聯(lián)系。本研究的開展對(duì)充分認(rèn)識(shí)白酒風(fēng)格的實(shí)質(zhì)具有積極意義，同時(shí)對(duì)開發(fā)新型風(fēng)味白酒具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水硫酸鈉、丙酮（均為分析純）：國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）：美國Thermo Fisher Scientific公司。

酒樣：分別來自貴州、四川和江蘇，相關(guān)信息見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)白酒酒樣信息Table 1 Information of the Baijiu samples used in the experiment

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、TSQ8000 Evo質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀：美國賽默飛世爾科技公司；ME204E型萬分之一天平：瑞士梅特勒-托利多國際有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒樣前處理

為了最大程度地保留樣本內(nèi)的化學(xué)成分，本方法采用直接進(jìn)樣分析。將選取的實(shí)驗(yàn)酒樣樣本各取1 mL，加入3 g無水硫酸鈉，混勻，過夜，12 000 r/min離心3 min，取上清液使用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，即上機(jī)測(cè)試。

1.3.2 色譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為TG-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25mm，0.25μm）；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；載氣（He）流速1.2 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持1 min；以6℃/min升溫至230℃，保持15 min；總分析時(shí)間為45 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源：電子能量70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；傳輸線溫度：230℃。定性采用全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍35～600 m/z。

1.3.3 定性和定量分析

定性分析方法：經(jīng)過分析得到的圖譜和美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，保留匹配度＞80%的組分。

定量分析方法：采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Trace Finder 4.1、SIMCA 14、Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性物質(zhì)及主成分聚類分析

不同香型白酒中揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS分析總離子流色譜圖見圖1。由圖1可知，醬香型酒樣揮發(fā)性物質(zhì)種類多于濃香型酒樣。經(jīng)過GC-MS數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，檢測(cè)出醬香型酒樣揮發(fā)性物質(zhì)62種，定性60種；濃香型酒樣檢測(cè)出揮發(fā)性物質(zhì)36種，定性35種。將兩種香型白酒定性出的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行組成種類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，醬香型酒樣揮發(fā)性物質(zhì)中的各類化合物種類均居濃香型酒樣之上，這與醬香型白酒獨(dú)特的“四高”釀造工藝是分不開的。發(fā)酵期的高溫可以促進(jìn)多種物質(zhì)的生成，而高溫蒸餾則使揮發(fā)性物質(zhì)最大限度的收集到酒中，從而使醬香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)種類較多。因此，推測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)種類的差異是導(dǎo)致醬、濃香型白酒酒體具有不同風(fēng)格特征的原因之一[14]。

圖2 醬、濃香型酒樣不同類型揮發(fā)性物質(zhì)組成差異Fig.2 Composition differences of volatile compounds between sauce-flavor Baijiu and strong-flavor Baijiu

主成分分析（PCA）是一種基于最大統(tǒng)計(jì)學(xué)距離投影的降維方法，可以較好地應(yīng)用于不同白酒的分析。采用SCIMA 14對(duì)酒樣進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，醬、濃香型白酒主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為73.50%，能有效描述揮發(fā)性物質(zhì)和酒樣之間的復(fù)雜關(guān)系，PCA可用于區(qū)分這兩種香型白酒。在同一95%置信區(qū)域（Hotelling T2 test）的兩種香型白酒，能各自較好的分開，聚類趨勢(shì)明顯，并具有直觀的可視化區(qū)分效果，可推測(cè)出兩種不同香型白酒香型與其揮發(fā)性物質(zhì)有直接聯(lián)系。

圖3 酒樣中揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析Fig.3 Principal components analysis of volatile compounds in Baijiu samples

4種醬香型酒樣中，M1～M3酒樣取自同一酒廠，3者PCA分布非常集中，這說明本檢測(cè)方法穩(wěn)定性較好；M4與M1～M3取自不同地區(qū)，但釀造工藝相似[15]，均為大曲醬香，而且M4與M1～M3的PCA分布接近，說明組分構(gòu)成非常相似。

由圖3可知，濃香型酒樣PCA分布較醬香型酒樣相對(duì)離散，揮發(fā)性物質(zhì)分別集中在第一和第四象限。濃香型4種酒樣分屬兩大濃香型白酒流派，S1和S2為川派代表，S3和S4為江淮派代表。除釀酒原料有所區(qū)別外，兩種流派濃香酒樣的發(fā)酵工藝各有的特點(diǎn)，S1和S2為跑窖法工藝，S3和S4為老五甑法工藝[16]。這說明，即使是同種香型的白酒，不同的釀造工藝會(huì)對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的形成造成一定影響。結(jié)果表明，酒樣揮發(fā)性物質(zhì)成分越接近，PCA分布越集中，基于主成分分析的方法能有效展現(xiàn)白酒不同香型、不同流派的揮發(fā)性物質(zhì)的個(gè)性與共性，能反應(yīng)白酒的實(shí)質(zhì)，白酒的風(fēng)格由它含有的揮發(fā)性物質(zhì)決定。

2.2 不同香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)差異分析

醬、濃香型酒樣揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS檢測(cè)數(shù)據(jù)，根據(jù)二位矩陣數(shù)據(jù)信息分析得到的Heatmap圖及揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量差異分別見圖4和表2。

圖4 醬、濃香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)差異分析熱圖Fig.4 Heatmap of differences analysis of volatile compounds in sauce-flavor Baijiu and strong-flavor Baijiu

由圖4可知，醬、濃香型酒樣在48種揮發(fā)性物質(zhì)含量上有所差異，其中39種存在顯著差異（P＜0.05），且醬香型酒樣有33種物質(zhì)相對(duì)含量高于濃香型酒樣。48種揮發(fā)性物質(zhì)中醇類物質(zhì)9種，醛類物質(zhì)2種，酸類物質(zhì)10種，酯類物質(zhì)15種，酮類物質(zhì)2種，呋喃類物質(zhì)4種，吡嗪類物質(zhì)3種，以及8種其他類物質(zhì)。

5-甲基糠醛、苯乙酸乙酯和琥珀酸乙酯是醬、濃香型酒樣中揮發(fā)性成分具有顯著差異的前三種物質(zhì)，這三種物質(zhì)也是醬、濃香型白酒重要的呈香物質(zhì)[17-19]，且在醬香型酒樣中的含量均高于濃香型酒樣。不僅如此，醬香型白酒獨(dú)特的“四高”工藝，促進(jìn)了呋喃類及吡嗪類化合物的生成，這兩類物質(zhì)在醬香型酒樣中的含量分別是濃香型酒樣的7.54倍和46.95倍，這與傳統(tǒng)的醬香型白酒酒體中糠醛及含氮化合物的含量居各香型之首的認(rèn)知相符[20-21]。另外，醬香型酒樣中醇類物質(zhì)相對(duì)含量是濃香型酒樣的2.53倍，其中以對(duì)白酒香氣有顯著貢獻(xiàn)的香味活性物質(zhì)β-苯乙醇含量差異最大[22]。醇類物質(zhì)在白酒中有協(xié)調(diào)香氣和“助香”的作用，有利于白酒呈香，而醇類物質(zhì)含量的差異或許是影響醬、濃香型白酒放香差異的原因之一。

表2 醬、濃香型白酒揮發(fā)性物質(zhì)差異分析Table 2 Differences analysis of volatile compounds between sauce-flavor Baijiu and strong-flavor Baijiu

續(xù)表

雖然醬香型酒樣的酯類物質(zhì)種類多于濃香型酒樣（見圖2），但酯類物質(zhì)作為濃香型白酒的主體香[23]，濃香型酒樣中酯類物質(zhì)的相對(duì)含量卻是醬香型酒樣的2.63倍，具有顯著差異（P＜0.05），且在濃香型酒樣中相對(duì)含量高于醬香型酒樣的前三種物質(zhì)均為酯類物質(zhì)，分別為己酸異戊酯、己酸己酯、己酸乙酯。作為四大酯之一的己酸乙酯，是濃香型白酒的主體香味物質(zhì)[24]，因己酸乙酯的閾值較低，賦予了濃香型白酒“窖香濃郁”之感[25]。

醬、濃香型白酒發(fā)酵工藝不同，泥窖發(fā)酵是濃香型白酒最具特色的釀造工藝之一。泥窖中的微生物代謝出多種對(duì)酒體有貢獻(xiàn)的揮發(fā)性物質(zhì)，但代謝出的一些異嗅物質(zhì)也會(huì)進(jìn)入酒體，如產(chǎn)生窖泥臭的主要物質(zhì)4-甲基苯酚[26]，由表2可知，它在濃香型酒樣中的相對(duì)含量是醬香型酒樣的16.67倍，與己酸的相對(duì)含量相同。兩種香型酒樣酸類物質(zhì)含量相當(dāng)，但有一些因釀造工藝不同而造成相對(duì)含量有明顯差異的酸類物質(zhì)，如濃香型酒樣中的乙酸和己酸相對(duì)含量分別是醬香型酒樣的0.22倍和16.67倍。這是由于濃香型白酒釀造所用的窖泥中含有大量的己酸菌，會(huì)促使乙酸向己酸轉(zhuǎn)化，而醬香型白酒釀造的條石窖池中的己酸菌含量非常少。因此醬香型白酒中的乙酸含量高于濃香型白酒，而己酸含量遠(yuǎn)低于濃香型白酒。

3 結(jié)論

本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（GC-MS）對(duì)醬、濃香型酒樣的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)分析。醬香型酒樣中檢測(cè)出揮發(fā)性物質(zhì)62種，定性60種。濃香型酒樣檢測(cè)出揮發(fā)性36種，定性35種。隨后，通過PCA分析發(fā)現(xiàn)，兩種香型酒樣聚類趨勢(shì)明顯，能根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)將兩種香型較好的區(qū)分。濃香型酒樣PCA聚類離散成兩大類，PCA能客觀反應(yīng)出不同流派的濃香型白酒揮發(fā)性成分的差異。

醬、濃香型酒樣在48種揮發(fā)性物質(zhì)含量上有差異。醬香型酒樣的呋喃類、吡嗪類及醇類化合物分別是濃香型酒樣的7.54倍、46.95倍和2.53倍。醬香型酒樣中酯類物質(zhì)的種類多于濃香型，但濃香型酒樣中酯類物質(zhì)相對(duì)含量卻是醬香型酒樣的2.63倍，且酒體中的己酸異戊酯、己酸己酯、己酸乙酯等酯類含量顯著高于醬香型酒樣。不同香型白酒的釀造工藝特點(diǎn)，會(huì)相應(yīng)的造成酒體中的揮發(fā)性物質(zhì)的差異，如濃香型酒樣中的4-甲基苯酚、己酸和乙酸分別是醬香型酒樣的16.67倍、16.67倍和0.22倍。釀造工藝的區(qū)別導(dǎo)致了酒體揮發(fā)性物質(zhì)的差異，賦予了醬、濃香型白酒不同的風(fēng)格特點(diǎn)。