葡萄白粉病潛在生防菌的篩選

杜興蘭，周建波，冉隆賢

(1.河北省塞罕壩機(jī)械林場總場， 河北圍場 068466； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 河北保定 071001)

葡萄白粉病是由葡萄白粉菌[Uncinulanecator(Schw.) Burr.]引起的一種真菌病害，幾乎遍布世界所有葡萄產(chǎn)區(qū)，嚴(yán)重影響葡萄生產(chǎn)[1-4]。生產(chǎn)上防治白粉病主要以化學(xué)農(nóng)藥為主，造成環(huán)境污染和果實殘留，使葡萄品質(zhì)下降，制約了葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5-6]。因此，有必要尋找一種高效、無污染的防治方法。

生物防治以其高效、低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點逐漸受到重視[7-8]。在國內(nèi)外，已有對黃瓜白粉病、小麥白粉病和葫蘆白粉病等生物防治方面的研究[9-10]，但截至目前，對葡萄白粉病的生物防治方面的研究尚未見報道。因此，篩選對葡萄白粉病防治較理想的生防菌株，具有十分重要的意義。筆者選用鏈霉菌、熒光假單胞桿菌和惡臭假單胞桿菌及其轉(zhuǎn)基因菌株，開展了葡萄白粉病生物防治的研究，旨在為開發(fā)葡萄白粉病的生防制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。鏈霉菌菌株：龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)、金色鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)、CN120(Streptomycessp.)和CN121(Streptomycessp.)。細(xì)菌菌株：惡臭假單胞桿菌WCS358r及其嗜鐵素缺失實變體JM218，轉(zhuǎn)基因菌株WCS358::phl、WCS358::phz和熒光假單胞桿菌CHA0r。WCS358::phl和WCS358::phz是通過遺傳工程的方法分別將產(chǎn)生2.4-二乙酰間苯三酚(2，4-diacetylphloroglucinol,DAPG)和吩嗪-1-羧酸的基因轉(zhuǎn)入到WCS358r的基因組中獲得轉(zhuǎn)基因菌株[11-13]。

熒光假單胞桿菌P.fluorescensWCS417分離自小麥根際土壤[14-15]。以該菌抗利福平的突變體WCS417r作為親本菌株，將產(chǎn)生2，4-二乙酰間苯三酚(DAPG)的基因phl[16]插入到WCS417r的染色體上，得到產(chǎn)生不同DAPG產(chǎn)量的12個菌株，分別命名為L1a12、L1b4、L1c4、L1d6、L2a12、L2b6、L2c9、L2d6、L3a12、L3b6、L3c6和L3d6。

1.1.2藥劑。20%三唑酮(triadimefon 粉銹寧)1 500倍液，山東東信生物農(nóng)藥有限公司。

1.1.3葡萄品種。葡萄品種來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃的葡萄新品種魏可葡萄。

1.2方法

1.2.1葡萄白粉菌孢子懸浮液的配制。從新鮮感病葉片上直接刮取白粉病菌的孢子，用無菌水配成濃度為3×105個孢子/mL。

1.2.2病原菌接種方法。從室外直接采集20～25 d新鮮葉片用自來水沖洗、晾干，每葉片接種5滴配好的白粉菌菌懸液，每滴10 μL，放至25 ℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，光照時間為12 h/d，20 d后對照充分發(fā)病時進(jìn)行記錄。

1.2.3葡萄離體葉片防治試驗。分別對4種鏈霉菌、10種生防菌進(jìn)行離體葉片試驗。在上述配好的生防菌菌懸液中浸泡20 min后，取出后室溫下晾干，以無菌水為對照，每個處理重復(fù)3次[17-20]，統(tǒng)計發(fā)病率。

1.2.4葡萄離體葉片治療試驗。先接種白粉病菌，在25 ℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5 d后，從培養(yǎng)皿中取出葉片，在上述配好的生防菌菌懸液中浸泡5 min，取出后自然條件下晾干，并以無菌水作為對照，每個處理重復(fù)3次，放至培養(yǎng)箱中繼續(xù)保濕培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計發(fā)病率。

發(fā)病率=接種點發(fā)病數(shù)/接種點總數(shù)×100%

1.3數(shù)據(jù)分析 利用DPS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1鏈霉菌防治效果由圖1可知，用生防鏈霉菌對葡萄葉片浸泡20 min后，對葡萄白粉病有一定的防治作用，其浸泡生防鏈霉菌的葉片發(fā)病率均低于對照。CN120和 CN121發(fā)病率分別為73.3%和66.7%，與對照無顯著差異；金色鏈霉菌和龜裂鏈霉菌浸泡處理后防治效果最好，其發(fā)病率分別為33.3%和40.0%，與對照相比分別降低了60.0和53.3百分點，這兩者之間差異不顯著，但顯著優(yōu)于對照。說明用金色鏈霉菌和龜裂鏈霉菌處理過的葡萄離體葉片在實驗室條件下能顯著提高對白粉病的抗性。

注：不同小寫字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level圖1 鏈霉病株對葡萄白粉病的防治效果Fig.1 Control effect of Streptomyces strains on Uncinula necator

2.2WCS417r及轉(zhuǎn)phl基因菌株防治效果離體葉片在生防菌菌懸液中浸泡接種后，20 d后觀察發(fā)病情況。由圖2可知，WCS417r和 L3b6發(fā)病率分別為45%和40%，有一定的防治作用，但無顯著差異。而L1d6、L2d6和L3d6這3個菌株發(fā)病率分別為30%、25%和15%，分別比對照降低了65.0、70.0、和80.0百分點，顯著優(yōu)于對照，而這3個菌株之間防治效果無顯著差異。說明L1d6、L2d6和L3d6這3個菌株能提高葡萄葉片對白粉病的抗性。

注：不同小寫字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level圖2 WCS417r及轉(zhuǎn)phl基因菌株對葡萄白粉病的防治效果Fig.2 Control effect of Pseudomonas spp.strains on Uncinula necator

2.3WCS358r及其轉(zhuǎn)基因菌株和常用藥劑防治效果由圖3可知，WCS358r、CHA0r和JM218發(fā)病率分別為53.3%、60.0%和53.3%，與對照相比發(fā)病率均降低，但與對照無顯著差異。而WCS358::phz和WCS358::phl和粉銹寧的發(fā)病率分別為40.0%、40.0%、和20.0%，分別比對照降低了53.3、53.3和73.3百分點，與對照相比差異顯著。

注：不同小寫字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercases stand for significant differences between different strains at 0.05 level圖3 WSC358r及轉(zhuǎn)基因菌株和常用藥劑對葡萄白粉病的防治效果Fig.3 Control effects of Pseudomonas spp.strains and potion on Uncinula necator

3 結(jié)論與討論

該研究通過白粉菌離體葉片試驗，從4株鏈霉菌中選出有防治作用的龜裂鏈霉菌和金色鏈霉菌；從WCS358r及其轉(zhuǎn)基因菌株中篩選出有防治效果的WCS358::phz和WCS358::phl菌株；從WCS417r及其轉(zhuǎn)phl基因菌株共5個菌株中篩選出L1d6、L2d6和L3d6 3株有防治效果的菌株。說明WCS358r和WCS417r的轉(zhuǎn)基因菌株具有增強(qiáng)防病的效果。由于環(huán)境因素的影響，在試驗過程中，篩選結(jié)果表現(xiàn)某些差異。因此在每次試驗中盡量選取一致的葡萄葉片，嚴(yán)格控制溫度和濕度，使條件一致。