食品中沙門氏菌檢測(cè)方法比較

程 浩

(安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽合肥 230051)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌，主要寄生于人類和動(dòng)物腸道傳染致病，可致腸熱癥、慢性腸炎、食物中毒等[1]。由于沙門氏菌經(jīng)常存活于肉制品、蛋類、水產(chǎn)品中，故世界各國(guó)普遍規(guī)定食品中不得檢出沙門氏菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)細(xì)菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起，人一旦攝入含有大量沙門氏菌(106～107個(gè)/g)的動(dòng)物性產(chǎn)品，就會(huì)引起細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素作用下發(fā)生食物中毒導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒，且沙門氏菌的傳播媒介眾多，肉、蛋以及食品從加工到出售的過(guò)程中都十分容易發(fā)生污染[2-3]，因此對(duì)沙門氏菌的檢驗(yàn)事關(guān)重大。目前常用的檢測(cè)方法有傳統(tǒng)方法(如國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、FDA、AOAC、FSIS、ISO、加拿大官方食品微生物分析方法)、儀器檢測(cè)法(如VIDAS、BAX)、商品化生化鑒定系統(tǒng)(VITEK GNI+、API 20E)[4-5]。筆者分別采用國(guó)標(biāo)GB4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)、MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法檢測(cè)食品中的沙門氏菌，比較3種檢測(cè)方法的檢測(cè)效果和檢出率。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗(yàn)陽(yáng)性菌種。腸炎沙門氏菌(CICC21513)來(lái)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2國(guó)標(biāo)GB4789.4—2016方法。緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)、亞酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、亞硫酸鉍瓊脂(BS)、三糖鐵瓊脂(TSI)、XLD培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、沙門顯色培養(yǎng)基、沙門氏菌生化鑒定試劑盒、沙門氏菌O多價(jià)抗原、H多價(jià)抗原均來(lái)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)。致病菌核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀、移液器、混勻器、恒溫金屬浴、高速離心機(jī)、迪澳沙門氏菌核酸檢測(cè)系列試劑盒均由廣州迪澳生物科技有限公司提供。

1.1.4MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡?？焖贆z測(cè)卡由北京良潤(rùn)生物科技有限公司提供。

1.2測(cè)試步驟

1.2.1國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016方法[6]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)后于(36±1)℃培養(yǎng)24 h，然后分別移取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基(TTB)，于42 ℃培養(yǎng)18～24 h；同時(shí)，另取1 mL轉(zhuǎn)種于10 mL 亞酸鹽胱氨酸增菌液(SC)內(nèi)，于(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸鉍瓊脂(BS)、XLD培養(yǎng)基、HE培養(yǎng)基、沙門顯色培養(yǎng)基上，于(36±1)℃分別培養(yǎng)18～24 h或40～48 h(BS)；觀察在各培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，如發(fā)現(xiàn)疑似菌，純化后做生理生化鑒定。

1.2.2基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)[7-8]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)后于(36±1)℃培養(yǎng)24 h得增菌液。用快速提取試劑盒提取增菌液中沙門氏菌的核酸，將處理液滴加于檢測(cè)試劑中混勻，使用迪澳恒溫PCR檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，自動(dòng)判讀結(jié)果。

1.2.3MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡[9]。取檢樣25 g，加入225 mL緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)后于(36±1)℃培養(yǎng)24 h得增菌液。移取1 mL增菌液到無(wú)菌試管中，于沸水中加熱10 min，冷卻后使用。打開檢測(cè)卡，在加樣孔中垂直滴加3～4滴(約100 μL)已滅菌的待檢樣品，等待8～10 min后，觀察檢測(cè)卡中部的檢視窗的結(jié)果。30 min后顯示結(jié)果無(wú)效。陽(yáng)性反應(yīng)：C、T線均顯色。陰性反應(yīng)：C線顯色，T線不顯色。失效反應(yīng)：C線不顯色，測(cè)試失敗或檢測(cè)卡失效。

2 結(jié)果與分析

2.1傳統(tǒng)檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)的63份食品樣品中，通過(guò)傳統(tǒng)國(guó)際GB4789.4—2016方法檢測(cè)，共檢出陽(yáng)性樣品2份。2份樣品經(jīng)前增菌、増菌、分離純化后的菌種在培養(yǎng)基上的形態(tài)符合沙門氏菌，其生理生化試驗(yàn)以及血清凝集試驗(yàn)均滿足沙門氏菌的性狀，判定檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

2.2快速檢測(cè)方法結(jié)果基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法都檢出了3份陽(yáng)性樣品。

2.3檢測(cè)結(jié)果的比較從表1可看出，檢測(cè)的63份食品樣品中，用傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016方法檢出2份陽(yáng)性樣品，檢出率3.2%；而基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法均檢出了3份陽(yáng)性樣品，檢出率均為4.8%。由此可見，基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法相比較具有較高的靈敏性和特異性。

表1 3種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比較

2.4檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較從表2可以看出，3種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法相比較具有操作方便、快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)，可以用于大批量食品中沙門氏菌的快速檢測(cè)和初篩；而國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016方法在國(guó)際上被廣泛承認(rèn)，是鑒定沙門氏菌的基準(zhǔn)方法。

表2 3種檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

2.5對(duì)于國(guó)標(biāo)中沙門氏菌檢測(cè)過(guò)程的思考

(1)前增菌和二次增菌都是必不可少的過(guò)程。食品中的沙門氏菌含量一般都很少并且會(huì)有多種細(xì)菌同時(shí)存在的情況，前增菌可以使受傷菌得到修復(fù)而增菌可以抑制一些雜菌的生長(zhǎng)，所以用前增菌和增菌分別進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，可以增加后期分離培養(yǎng)的檢出率。

(2)分離培養(yǎng)中應(yīng)注意當(dāng)不存在典型的或可疑的沙門氏菌菌落時(shí)，按如下步驟檢驗(yàn)非典型的沙門氏菌菌落：①HE和XLD。非典型的沙門氏菌在HE和XLD瓊脂上呈黃色菌落，帶或不帶黑色中心。HE和XLD平板經(jīng)(24±2)h培養(yǎng)后，沒(méi)有典型的沙門氏菌菌落，則挑取2個(gè)或更多個(gè)非典型的沙門氏菌菌落。②BS瓊脂。某些非典型菌株產(chǎn)生綠色菌落，其周圍培養(yǎng)基稍微或不呈暗色。如果BS平板培養(yǎng)(24±2)h后，沒(méi)有出現(xiàn)典型菌落，則不挑取任何菌落讓平板繼續(xù)培養(yǎng)(24±2)h。如果經(jīng)(48±2)h培養(yǎng)后，仍沒(méi)有典型或可疑菌落出現(xiàn)，則挑取2個(gè)或更多個(gè)非典型的菌落。

(3)TSI要制備成高柱斜面，有助于結(jié)果判讀，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)先劃線再穿刺，先穿刺再劃線會(huì)由于含菌量太高，如果產(chǎn)H2S變黑，難以觀察底層的產(chǎn)酸現(xiàn)象，并且如果產(chǎn)氣較多的話培養(yǎng)基會(huì)被頂出很高更有甚者可能會(huì)頂開試管塞。典型沙門氏菌在TSI上斜面呈紅色，底端呈黃色，有氣體產(chǎn)生，90%形成H2S，瓊脂變黑。但對(duì)于乳糖陽(yáng)性的沙門氏菌斜面也呈黃色，因此不能僅僅根據(jù)三糖鐵培養(yǎng)的結(jié)果就確認(rèn)沙門氏菌。

(4)目前沒(méi)有一種培養(yǎng)基能準(zhǔn)確無(wú)誤地篩選出沙門氏菌，因此必須選擇多種選擇性培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行篩選，顯色培養(yǎng)基只是綜合選擇性更強(qiáng)，試驗(yàn)人員不能只在選擇性培養(yǎng)基和TSI 特征符合而沒(méi)有把關(guān)鍵的生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定完成的情況下就報(bào)結(jié)果，這樣很可能導(dǎo)致結(jié)果假陽(yáng)性。

(5)血清學(xué)鑒定是沙門氏菌檢驗(yàn)中的重要鑒定方法，包括菌體抗原(O)鑒定、鞭毛抗原(H)鑒定和Vi抗原鑒定。血清檢測(cè)時(shí)要使用24 h內(nèi)的純菌，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察結(jié)果，并做自凝試驗(yàn)。凝集不好的室溫(不要放冰箱)放置1～2 d或者傳代一次再凝集，可能凝集的情況會(huì)好些。如果實(shí)驗(yàn)室條件許可建議購(gòu)置進(jìn)口血清(以泰國(guó)和丹麥血清為佳)，如果用國(guó)產(chǎn)血清盡量同時(shí)使用2種廠家產(chǎn)品互相驗(yàn)證。

(6)沙門氏菌結(jié)果判定應(yīng)該以生化試驗(yàn)結(jié)果為主，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行血清學(xué)判定。直接用多價(jià)血清進(jìn)行試驗(yàn)而不進(jìn)行生化試驗(yàn)是絕對(duì)不可取的。因?yàn)檠鍖W(xué)的原理是抗原抗體結(jié)合，非沙門氏菌的微生物也有可能帶有沙門的類似抗原，這樣的操作可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性，因此在做鑒定時(shí)必須先進(jìn)行生化試驗(yàn)，再在生化試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

(7)如果只需要鑒定某個(gè)菌株是否屬于沙門氏菌，那只需要做O多價(jià)和H多價(jià)血清就可以了(大多數(shù)食源性沙門氏菌凝集A-F群O多價(jià))。如果要鑒定某個(gè)菌株具體是什么沙門氏菌，那就需要進(jìn)行血清學(xué)分型試驗(yàn)，從多價(jià)血清一直做到O抗原和H抗原的單因子，然后參照《GB 4789.4—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》附錄B的表格查找對(duì)應(yīng)的沙門氏菌名。

(8)在做血清學(xué)鑒定時(shí)，O多價(jià)血清如果沒(méi)有凝集并不能直接判定為陰性，因?yàn)檫€要考慮Vi抗原的影響。Vi抗原屬于K抗原群會(huì)阻隔O抗原和相應(yīng)抗體的結(jié)合，所以當(dāng)Vi抗原存在時(shí)，O多價(jià)血清是不會(huì)凝集的，因此必須去除Vi抗原的影響。具體方法是挑取菌苔于1 mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查如果還是不凝集，才能判定為陰性。

3 結(jié)論與討論

該研究分別采用國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016、基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)、MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法檢測(cè)食品中的沙門氏菌，比較3種檢測(cè)方法的檢測(cè)效果和檢出率。結(jié)果顯示，檢測(cè)的63份食品樣品中，用國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016方法檢出2份陽(yáng)性樣品，檢出率3.2%，檢測(cè)時(shí)間至少為6 d；而基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法均檢出了3份陽(yáng)性樣品，檢出率均為4.8%，并且可以在30 h內(nèi)出結(jié)果。從靈敏度和特異性角度來(lái)看，基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法相比較具有快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)；從檢測(cè)周期來(lái)看，國(guó)標(biāo)GB 4789.4—2016微生物培養(yǎng)法中培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，最短的檢測(cè)周期為6 d，而基于迪澳生物核酸恒溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)的致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)和MICRO FAST沙門氏菌快速檢測(cè)卡的方法2 d即可出結(jié)果，可以用于大批量食品中沙門氏菌的快速檢測(cè)和初篩，也可以作為國(guó)標(biāo)方法的有效補(bǔ)充。