響應面優(yōu)化西蘭花副產(chǎn)物ITC提取及抗氧化性研究

（永城職業(yè)學院食品化工系，河南永城 476600）

西蘭花（Brassica oleracea L.ver.Italica Plenck），屬十字花科（Cruciferae）蕓苔屬（Brassica）甘藍種的一個變種。流行病學研究表明，一般食用蕓苔蔬菜，特別是西蘭花，會降低許多非傳染性疾病的風險。蕓苔蔬菜類對健康促進作用通常主要歸于其次生代謝產(chǎn)物水解產(chǎn)生的異硫氰酸酯（isothiocyanate，ITC），而硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷glucosinolates，GS）則是其前體。近來研究表明，異硫氰酸酯能夠改變環(huán)境致癌物質(zhì)的代謝和排泄從而具有良好的抗癌作用[1]，ITC預防癌變的第二種機制是能誘導癌細胞周期停滯和凋亡，從而抑制腫瘤的生長[2]；此外ITC還具有抗癌、調(diào)節(jié)免疫活性、預防心血管疾病和保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[3-4]。由于ITC具有多重抗癌功效而被視為現(xiàn)代新型防癌、抗癌物質(zhì)。

西蘭花是十字花科主要的作物之一，然而在生產(chǎn)鏈的不同階段產(chǎn)生了大量西蘭花邊角廢料和副產(chǎn)品，其中葉和莖大約占西蘭花的總重量的40%～50%左右[5]。西蘭花總GS含量低于其他常見的蕓苔蔬菜[6]，其莖和葉GS含量也比西蘭花種子含量低，但西蘭花種子價格高達4 000元/kg[7]，生產(chǎn)成本高昂；盡管其總GS含量較低，但西蘭花收獲后廢棄物指數(shù)高，其產(chǎn)生大量有機固體廢物用來提取GS具有經(jīng)濟可行性，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。這些西蘭花副產(chǎn)物是構(gòu)成高附加值化合物的重要來源，可以用于食品添加劑或開發(fā)新的功能性食品。而傳統(tǒng)有機浸提西蘭花ITC的工藝存在安全問題，或因溫度過高導致產(chǎn)率低的問題[8-9]；因此與傳統(tǒng)提取技術(shù)相比，急需開發(fā)新的提取技術(shù)以縮短提取時間、減少溶劑消耗并提高提取率；超聲輔助提取利用超聲空化效應，促進細胞破裂增加溶劑的滲透，從而提高提取率[10-12]。

本試驗以西蘭花副產(chǎn)物為原料，通過超聲波輔助提取ITC，采用比色法測定ITC含量，通過單因素試驗研究超聲功率、超聲時間、料液比以及超聲溫度等因素對ITC提取率的影響，在單因素基礎(chǔ)上進行響應面優(yōu)化，得出最佳提取工藝參數(shù)。并將提取得到的ITC進行體外抗氧化活性研究，以期為西蘭花副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料和設(shè)備

1.1 材料和試劑

新鮮西蘭花副產(chǎn)物（莖）：市售。

乙醇、氯化鐵、氯化亞鐵、磷酸鹽緩沖液、福利酚試劑、1，2-苯二硫酚（均為分析純）：南京化工廠；甲醇、乙腈（均為色譜純）：天津市光復科技發(fā)展有限公司；萊菔硫烷標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：Sigma，UK；2，4，6-三吡啶基三嗪：Bio-rad。

1.2 儀器

HH恒溫水浴鍋：金壇市中大儀器廠；VGT-1860 QTD固特超聲單槽超聲波清洗機：廣東固特超聲股份有限公司；FA2004N電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TG16臺式離心機：長沙英泰儀器有限公司；烘箱：天津天有利科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 西蘭花副產(chǎn)物預處理

將新鮮的西蘭花莖洗凈，用刀切成薄片（0.1 cm～0.3 cm）后迅速在90℃熱燙5 min進行滅酶處理。將滅酶后得西蘭花薄片在60℃下恒溫干燥后粉碎過60目篩得到西蘭花莖粉末（broccoli stem powder，BSP）備用。

2.2 ITC提取工藝

稱取3份1 g BSP并加入10 mL蒸餾水于3個50 mL三角瓶中，在提取溫度為40℃、超聲功率為60 W條件下提取20 min。提取結(jié)束后在4 000 r/min條件下離心15 min，收集上清；沉淀再用10 mL蒸餾水水洗后離心，合并上清液過濾，測定樣品ITC、總酚含量以及抗氧化活性。

2.3 ITC提取單因素試驗

選擇超聲提取溫度、超聲提取時間、超聲提取功率、料液比以及pH值為研究變量，考察超聲提取溫度、超聲提取時間、超聲提取功率、料液比以及pH值對西蘭花副產(chǎn)物ITC提取產(chǎn)率的影響。

2.4 響應面分析試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選取超聲功率、超聲時間、提取溫度和料液比4個影響最為顯著的因素為自變量，采用四因素三水平的響應面試驗設(shè)計，見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

2.5 西蘭花ITC的測定方法

2.5.1 ITC標準曲線

ITC與1，2-苯二硫酚發(fā)生環(huán)化縮合反應生成1，3-苯并二硫代-2-硫酮在365 nm處有特征吸收峰；且該反應不受硫氰酸鹽、氰酸鹽、異氰酸鹽等相關(guān)物質(zhì)的干擾，同時該方法靈敏度高，測定下限低于1 nmol；因此采取該法簡便可行。按照zhang等[13]的方法略有修改；將萊菔硫烷標準品用甲醇配制成1、10、20、30、40 μmol/L，分別取0.1 mL置于2 mL具塞管中依次加入 0.9 mL 0.1 mol/L pH 8.5 PBS 和 1 mL 8 mmol/L 1，2-苯二硫酚甲醇溶液，在60℃水浴振蕩反應30 min后；于365 nm處測定吸光值。標準曲線方程如下：

y=0.925 7x+0.016 62，R2=0.997 2

式中：y為待測液在365 nm處的吸光度（A365）；x為ITC含量，μmol/L。

2.5.2 樣品ITC含量測定

取上清濾液0.1 mL置于試管中，依次加入0.9 mL 0.1 mol/L pH 8.5磷酸鹽緩沖液和1 mL 8 mmol/L 1，2-苯二硫酚甲醇溶液，在60℃水浴振蕩反應30 min后；于365 nm處測定吸光值。

2.6 ITC抗氧化能力測定

2.6.1 DPPH測定[15]

在 5 μL 樣品中加入 245 μL 0.1mmol/L DPPH 甲醇溶液，于室溫反應30 min后，在517 nm處測定樣品和標準對照Trolox對DPPH自由基的清除能力，結(jié)果用mmol/mL Trolox相對值表示。

2.6.2 ABTS+自由基測定

根據(jù)Biegańskamarecik等[16]ABTS+法測定自由基清除活性。將0.007 mol/L ABTS+自由基溶液與0.002 mol/L過硫酸鉀溶液以1∶0.5（體積比）混合在室溫下避光放置12 h～16 h。測定前，將ABTS+自由基溶液用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋直到ABTS+自由基溶液達到0.700±0.020的吸光度。將提取上清液（50 μL）與5 mL稀釋的ABTS+自由基溶液混合，37℃下反應5 min后在734 nm測定其吸光度A734，以PBS緩沖液用作空白。平行測定3次，根據(jù)以下公式算ABTS+自由基的清除率，結(jié)果用μmol/mL Trolox相對值表示。

ABTS+自由基清除率/%=[1-A/A0]×100

式中：A為樣品吸光值；A0為空白吸光值。

2.6.3 ITC還原能力測定[15]

現(xiàn)配Ferric reduction ability power（FRAP）溶液：0.3 mol/L pH 3.6醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L溶于40mmol/LHCl的 2，4，6-三吡啶基三嗪溶液和 20mmol/L FeCl3以10∶1∶1體積比混合。取5μL樣品中加入245μL FRAP溶液，于室溫反應10 min后，在593 nm處測定樣品和標準對照Trolox還原Fe3+的能力，結(jié)果用mmol/mL Trolox相對值表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 超聲功率對ITC提取量的影響

超聲功率對ITC提取的影響見圖1。

圖1 超聲功率對ITC提取的影響Fig.1 The effect of ultrasonic power on the extraction volume of ITC

由圖1可知，超聲功率由20 W～100 W過程中，ITC含量不斷增大，在60 W時吸光度值最大為0.850（ITC含量為803 μmol/L），當超聲功率繼續(xù)增大時，ITC含量開始下降，原因是超聲功率的增大使得ITC水解被破壞[17]；由于在60 W和80 W測得的吸光度值無顯著差異（n=3，p＞0.05），考慮節(jié)約能源與工業(yè)化生產(chǎn)經(jīng)濟可行性等因素條件下超聲功率選取60 W為宜。

3.1.2 超聲時間對ITC提取量的影響

超聲時間對ITC提取的影響見圖2。

圖2 超聲時間對ITC提取的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extraction volume of ITC

由圖2可知，超聲時間由10 min～20 min過程中，ITC含量不斷增大，在20 min時吸光度值最大為0.727（ITC含量為690 μmol/L），當進一步延長超聲時間，ITC含量開始下降，可能是因為超聲時間過長導致產(chǎn)物水解。因此超聲時間選擇15 min為宜。

3.1.3 提取溫度對ITC提取量的影響

提取溫度對ITC提取的影響見圖3。

由圖3可知，提取溫度由20℃～60℃過程中，ITC含量快速增加后變得緩慢，而后開始下降，提取過程中因為超聲的空化效應和芥子苷酶活性逐漸增大，ITC的含量急劇增大；當繼續(xù)增大溫度時，由于硫苷熱不穩(wěn)定性和酶活性下降，同時ITC開始發(fā)生降解，因而ITC含量開始下降[18]；因此，提取溫度選取30℃為宜。

圖3 提取溫度對ITC提取的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction volume of ITC

3.1.4 料液比對ITC提取量的影響

料液比對ITC提取的影響見圖4。

圖4 料液比對ITC提取的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction volume of ITC

由圖4可知，在增大提取液過程中，ITC含量不斷增大后趨于水平，當提取液用量小時，ITC未能充分溶出；而當提取液用量不斷增大時，ITC溶出率趨于飽和。當料液比為1∶20（g/mL）吸光度值最大為0.567（ITC 含量為 541 μmol/L），由于料液比為 1 ∶15（g/mL）和1∶20（g/mL）的吸光值在統(tǒng)計學上無顯著性（p＞0.05），因此，料液比選取 1 ∶15（g/mL）為宜。

3.1.5 pH值對ITC提取量的影響

pH值對ITC提取的影響見圖5。

由圖5可知，pH 5～8范圍內(nèi)有利于ITC的生成，當pH值小于5時，硫苷在黑介子酶作用下主要形成氰類物質(zhì)，在pH 5～8范圍內(nèi)生成異硫氰酸酯類物質(zhì)。由圖可知pH 5～8范圍內(nèi)有利于ITC的生成，結(jié)合已有文獻選擇pH 7為宜[19]。

圖5 pH值對ITC提取的影響Fig.5 The effect of pH on the extraction volume of ITC

3.2 響應面法優(yōu)化ITC提取工藝

采用Design-Expert 8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合二次多項式方程，用R2表示擬合度；采用F檢驗對響應面試驗數(shù)據(jù)進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計學意義。

3.2.1 Box-Behnken設(shè)計方案及試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取超聲時間、超聲功率、提取溫度和pH值作為主要因素，以ITC濃度（mmol/L）為響應值。依據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計試驗方案，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及試驗數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

續(xù)表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及試驗數(shù)據(jù)結(jié)果Continue table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental result

3.2.2 模型建立及方差分析

運用Design-Expert 8.0.6對表2的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到以硫苷含量（Y）為響應值的擬合方程：

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，pH（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C）、超聲時間（D）、超聲時間和超聲功率的交互項（BD）、pH 值二次項（A2）、超聲功率二次項（B2）、提取溫度二次項（C2）和超聲時間二次項（D2）達到極顯著水平（p＜0.01）；超聲功率和提取溫度交互項（BC）與提取溫度和超聲時間交互項（CD）達到顯著水平（p＜0.05）。這說明選取的試驗因素對響應值不是簡單的線性關(guān)系，還能看出各因素對ITC含量的影響大小順序：D＞A＞B＞C。

表3 響應面二次回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

該模型的 R2值為 0.986 4（p＜0.000 1），虛擬項不顯著（p=0.176 4），說明通過二次回歸得到的ITC含量模型與試驗擬合度良好、誤差??；模型的校正系數(shù)RAdj2=0.972 9，表明此回歸模型可以解釋97.29%響應值變化，說明此法可靠、具有可行性。

通過軟件分析得最佳提取條件為：超聲時間16.08 min、超聲功率63.46W、提取溫度40.05℃、pH 6.23，在此條件下ITC提取量的預測值為0.905 6 mmol/L。基于工業(yè)化實際可操作性等因素考慮，將最佳提工藝條件調(diào)整為：超聲時間16 min、超聲功率63 W、提取溫度40℃、pH 6.2，在此條件下進行3次平行試驗，提取的ITC含量為0.895 mmol/L，與理論值相對誤差為1.2%，說明試驗結(jié)果與模型符合良好。

3.2.3 因子交互作用分析

應用Design-Expert 8.0.6軟件分析因素交互作用響應面及等高線圖（見圖6～圖11），通過該組動態(tài)圖即可對任何兩個因素交互影響提取西蘭花副產(chǎn)品ITC含量的效應進行分析與評價。所擬合的響應曲面和等高線圖能較直觀地反映各因素間的交互作用對響應值的影響，其中等高線呈圓形說明兩個因素交互作用不顯著，等高線呈橢圓說明兩個因素交互作用顯著。

圖6 pH值和超聲功率交互作用影響ITC提取量的曲面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of ITC versus pH and ultrasonic power

圖7 pH值和提取溫度交互作用影響ITC提取量的曲面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of ITC versus pH and extraction temperature

圖8 pH值和超聲時間交互作用影響ITC提取量的曲面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of ITC versus pH and ultrasonic treatment time

由圖6～圖11可以看出，每個響應曲面均為開口向下的凸形曲面，每個響應面都有極高值，出現(xiàn)在等高線的圓心處。其中pH值（A）和超聲時間（D）的等高線圖與圓形最接近，說明他們之間的交互作用對ITC含量提取的影響最小，其次是pH值（A）和超聲溫度（C）、pH值（A）和超聲功率（B）。而等高線越扁平則表示兩因素的交互作用越大，提取溫度（C）和超聲功率（B）的交互作用對ITC提取量的影響作用最大。

圖9 提取溫度和超聲功率交互作用影響ITC提取量的曲面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of ITC versus ultrasonic power and extraction temperature

圖10 提取溫度和超聲時間交互作用影響ITC提取量的曲面圖和等高線圖Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of ITC versus extraction temperature and ultrasonic treatment time

圖11 提取溫度和超聲時間交互作用影響ITC提取量的曲面圖和等高線圖Fig.11 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of ITC versus ultrasonic power and ultrasonic treatment time

3.3 西蘭花ITC抗氧化結(jié)果分析

西蘭花ITC抗氧化能力分析見表4。

表4 ITC的抗氧化能力（當量mmol/L Trolox，n=3）Table 4 Antioxidants activities of ITC（mmol/L Trolox equivalent，n=3）

西蘭花ITC抗氧化結(jié)果顯示：西蘭花ITC于100 mg/mL劑量對DPPH自由基的清除能力為0.623個Trolox當量（1 mmol/L Trolox的清除自由基的能力）；清除ABTS+自由基的能力為0.463個Trolox當量；對鐵離子的還原能力為0.573個Trolox當量。

4 結(jié)論

通過超聲輔助提取西蘭花副產(chǎn)物中的ITC，得出的最優(yōu)工藝組合為：超聲時間16 min、超聲功率63 W、提取溫度40℃、pH 6.2，在此條件下進行3次平行試驗，提取的ITC含量為0.895 mmol/L，與理論值相對誤差為1.2%，說明試驗結(jié)果與模型符合良好。提取物ITC清除DPPH自由基的能力為0.623個Trolox當量、清除ABTS+自由基的能力為0.463個Trolox當量；對鐵離子的還原能力為0.573個Trolox當量；表明該方法優(yōu)化提取的ITC具有良好的抗氧化功能。