毛冬青葉中總黃酮提取工藝及其抗氧化性能研究

唐婷范，鄧起東，李曉慧，田玉紅

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

毛冬青（Ilex pubescens）為冬青科中的冬青屬植物，別名茶葉冬青、山冬青，是我國(guó)南方分布廣泛的林葉資源，毛冬青葉的成分相對(duì)復(fù)雜，其化學(xué)成分包括揮發(fā)油、黃酮、酚類物質(zhì)、香豆素、氨基酸、甾體、萜烯、糖類等。目前已對(duì)毛冬青根的化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行了比較系統(tǒng)的探討[1-8]，如廖立平等[9]從毛冬青葉中分離出5種黃酮類化合物，分別為紫云英昔、山奈酚、山柰素-D-半乳糖苷、槲皮素、洋芹素，并且首次從冬青屬植物中分離得到山柰素3-0-e-D-半乳糖苷。

黃酮類化合物（flavonoids）是一類存在于自然界的具2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物。黃酮類化合物具有多種藥理活性，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抑菌消炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)和肝臟、延緩衰老抗疲勞、提高免疫力、營(yíng)養(yǎng)和雌激素作用、促進(jìn)消化、提高神經(jīng)興奮性、抗氧化及清除自由基等良好的藥理作用和生物活性[10-12]。王明艷等[13]優(yōu)化了毛冬青根黃酮提取條件，為了綜合利用資源，擴(kuò)大藥源，為毛冬青葉的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，本試驗(yàn)對(duì)毛冬青葉中總黃酮提取工藝及其抗氧化性能進(jìn)行初步研究，對(duì)于充分利用毛冬青資源具有非常重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛冬青葉：產(chǎn)于云南；蘆丁、碳酸鈉、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、六水合氯化鋁、氯化鐵、七水合硫酸亞鐵（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；無水乙醇（分析純）：臺(tái)山市粵僑試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：廣東光華化學(xué)廠有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：廣東汕頭市西隴化工廠；變色硅膠（化學(xué)純）：青島裕寶精細(xì)化工有限公司；水楊酸（分析純）：中國(guó)華東師范大學(xué)化工廠（上海）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（分析純）：日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

722N可見分光光度計(jì)、JJ200電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；101-1A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毛冬青葉中總黃酮成分的提取[14]

稱取2.0 g烘干的毛冬青葉，用60%的乙醇水溶液作為提取介質(zhì)，在60℃的溫度下回流提取2.0 h，提取完成后抽濾，得到粗黃酮提取液。

1.3.2 毛冬青葉中總黃酮含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]，配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，以亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法，采用可見分光光度法對(duì)毛冬青葉總黃酮提取率進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 毛冬青葉中總黃酮的提取工藝條件優(yōu)化

考察提取溶劑濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)毛冬青葉總黃酮提取率的影響，根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，選出最優(yōu)化的相鄰三組，再結(jié)合正交法試驗(yàn)對(duì)總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 毛冬青葉中總黃酮的抗氧化性能

將濃縮后的黃酮浸膏溶解于適量濃度為60%乙醇溶液中，配成不等同質(zhì)量濃度的水溶液，分別運(yùn)用Fenton與DPPH法[16]，測(cè)定各試樣不等同濃度時(shí)的A520nm與A517nm，并計(jì)算其對(duì)OH·和DPPH自由基的消除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛冬青總黃酮的定量分析方法

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱量5.0 mg干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，以少量60%的乙醇攪拌溶解，而后將其移至50 mL的容量瓶中并定容到刻度，搖勻，得到濃度是0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

精確吸取 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次放于體積為25 mL的具塞比色管中，再加入1 mL濃度為5%的NaNO2溶液，混勻靜置6 min，再加入1 mL濃度為10%的A（lNO3）3溶液，搖勻后靜置6 min，最后加入10 mL 4%的NaOH溶液，混合后靜置15 min，最后加入濃度為60%的乙醇定容到25 mL。測(cè)定試驗(yàn)所需波長(zhǎng)，用可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為450 nm～600 nm內(nèi)對(duì)本體系溶液進(jìn)行掃描測(cè)定吸光度值，結(jié)果表明蘆丁樣液在508nm處吸收最大。在波長(zhǎng)為508nm處測(cè)量不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，根據(jù)測(cè)量的結(jié)果繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程是：y=11.927x-0.029 1，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)液的曲線線性范圍為：0.002 mg/mL～0.014 mg/mL，精密度和穩(wěn)定性的RSD值分別為0.49%和1.44%，說明該分析方法可行。

2.1.2 總黃酮得率的計(jì)算

式中：A為提取液總黃酮的吸光度；V取為移液針取提取液的體積，mL；V液為所用的乙醇溶液提取的體積，mL。

2.2 毛冬青葉中總黃酮的提取工藝條件優(yōu)化

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱量5份干燥的毛冬青葉2.000 g，以料液比為1∶60（g/mL），溫度為60℃，用50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液回流提取2 h，提取完后，抽濾得到的上清液定容到相應(yīng)體積，按亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法顯色，用可見分光光度計(jì)測(cè)定不同乙醇濃度下提取的毛冬青葉總黃酮的吸光度值，即得到不同提取介質(zhì)的濃度影響毛冬青葉總黃酮提取率的關(guān)系見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extracting ratio of flavonoids

由圖2可知，毛冬青葉總黃酮的提取率受提取介質(zhì)濃度的影響很大，當(dāng)提取介質(zhì)（乙醇）的濃度為60%時(shí)，提取液中總黃酮的得率最高，當(dāng)提取介質(zhì)濃度超過60%后，隨著提取介質(zhì)濃度的增加，毛冬青葉提取液總黃酮的得率逐漸下降。此結(jié)果可能是由于毛冬青葉黃酮類化合物在高濃度的提取介質(zhì)中溶解度下降，因此提取率也隨之下降。所以，選用60%的乙醇溶液為提取劑。

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱量5份干燥的毛冬青葉2.000 g，用濃度為60%的乙醇溶液為提取溶劑，加入不同梯度的料液比，即料液比為 1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL），60℃下回流提取2 h，抽濾后定容到相應(yīng)體積，然后按亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法顯色，用可見分光光度計(jì)測(cè)定不同料液比下提取的毛冬青葉總黃酮的吸光度值，即得到毛冬青葉總黃酮提取率受料液比影響的關(guān)系見圖3。

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of ratio of material to solvent on the extracting ratio of flavonoids

由圖3可知，不同的料液比對(duì)提取率有很大影響，在低料液比的提取介質(zhì)（乙醇）中，隨著料液比的加大，原料中的總黃酮提取率逐漸升高；當(dāng)料液比到達(dá)為1∶60（g/mL）時(shí)，隨著料液比的升高，原料中的總黃酮提取率緩慢下降。這種結(jié)果也許是當(dāng)溶劑加多的過程中，提取液中黃酮被加入的溶液稀釋，導(dǎo)致其濃度降低，使得毛冬青葉中黃酮浸出，從而總黃酮的提取率增加。當(dāng)達(dá)到料液比為1∶60（g/mL）后，由于提取液中總黃酮的濃度不是毛冬青葉中總黃酮的浸出主要影響因素，所以結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益，選用料液比為1∶60（g/mL）較為合算。

2.2.3 提取溫度對(duì)總黃酮提取的影響

準(zhǔn)確稱量5份干燥的毛冬青葉2.000 g，用濃度為60%的溶液乙醇為提取劑，加入的料液比是1∶60（g/mL），分別在 40、50、60、70、80 ℃的溫度下提取 2 h，抽濾后定容到相應(yīng)體積，然后按亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色方法顯色，用可見分光光度計(jì)測(cè)量不同的料液比下提取的毛冬青葉提取物的吸光度值，即得到提取液中總黃酮的含量受加熱溫度的影響關(guān)系見圖4。

由圖4可知，加熱的溫度對(duì)毛冬青葉中總黃酮的提取有較大的影響，當(dāng)加熱溫度低于50℃時(shí)，由于加熱溫度的增高，加快了分子浸出的速率，從而提取液中的黃酮含量增加；當(dāng)溫度為50℃時(shí)，提取液中的黃酮含量最高；當(dāng)加熱溫度超過50℃后，由于提取體系溫度的增加，浸出的黃酮被氧化或被高溫破壞掉，導(dǎo)致提取體系中總黃酮量降低，而加熱會(huì)使提取介質(zhì)量減少，提取液中總黃酮濃度增加，使得毛冬青葉中黃酮難浸出，因此也會(huì)使其提取率降低。因此選用溫度為50℃為提取溫度。

圖4 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of extracting temperature on the extracting ratio of flavonoids

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

精確稱量5份干燥的毛冬青葉2.000 g，用濃度為60%的乙醇溶液為提取劑，加入提取劑的料液比是1 ∶60（g/mL），在 60℃的溫度下回流提取，分別提取 2、3、4、5、6 h，抽濾后定容到相應(yīng)體積，然后按亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法顯色，用可見分光光度計(jì)測(cè)量不同加熱時(shí)間下毛冬青葉提取液的吸光度值，即得到加熱時(shí)間對(duì)其提取率的影響關(guān)系，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of extracting time on the extracting ratio of flavonoids

由圖5可知，加熱時(shí)間對(duì)于毛冬青葉總黃酮的提取率存在一定的影響，在加熱時(shí)間小于4 h時(shí)，隨著加熱時(shí)間的增長(zhǎng)，提取液中的總黃酮提取率逐步升高，原因可能是因?yàn)樵诖藭r(shí)間段內(nèi)，黃酮不斷地從毛冬青葉中浸出，從而其提取率逐步升高；當(dāng)加熱時(shí)間為4 h時(shí)，黃酮的提取率達(dá)到最高值，為14.22%；在加熱4 h后，其提取率逐步降低，也許是由于提取液被長(zhǎng)時(shí)間加熱導(dǎo)致其中的黃酮被氧化或分解。但是加熱時(shí)消耗巨大能量的過程，綜合經(jīng)濟(jì)考慮，選用提取時(shí)間為4 h為最經(jīng)濟(jì)的提取時(shí)間。

2.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化毛冬青葉總黃酮提取工藝條件

依據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果可知，從提取液濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素中，找出最優(yōu)因素和相鄰的兩組試驗(yàn)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定正交試驗(yàn)的因素水平的選取見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

根據(jù)表1確定的因素水平，考察單因素間的相互交叉影響，準(zhǔn)確稱量干燥的毛冬青葉2.000 g，分別進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，得到總黃酮的提取率，結(jié)果見表2。

由表6結(jié)果可知，提取介質(zhì)濃度和料液比在毛冬青葉總黃酮的提取中有很大影響，而提取時(shí)間和提取溫度對(duì)其總黃酮的提取影響較小。由極差R分析可知，對(duì)黃酮提取率的影響次序?yàn)榱弦罕龋疽掖紳舛?提取時(shí)間＞提取溫度，優(yōu)化后最好的提取工藝為A2B2C2D1。即提取介質(zhì)（乙醇）濃度為60%、料液比為1∶60（g/mL）、提取時(shí)間為5 h、提取溫度為50℃。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，在此提取條件下總黃酮的提取率最高為15.08%。

2.3 毛冬青葉總黃酮的抗氧化性研究

2.3.1 毛冬青總黃酮清除羥基自由基（·OH）試驗(yàn)

毛冬青總黃酮對(duì)·OH的清除作用，以蘆丁作對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 不同濃度試樣對(duì)·OH清除率的影響Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of different samples

毛冬青葉總黃酮具有一定的抗氧化作用，由曲線可知，在濃度升高得過程中，其對(duì)于·OH的清除作用逐步增加。在與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的對(duì)比中可以看出，不同濃度的樣液對(duì)于·OH的清除作用的變化規(guī)律是相似的，樣液對(duì)于·OH的清除率最大值為45.96%。因此，毛冬青葉中的總黃酮對(duì)于·OH的清除有很好的效果。

2.3.2 毛冬青總黃酮清除DPPH自由基（DPPH·）試驗(yàn)

毛冬青總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用，以蘆丁做對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 不同濃度試樣對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.7 DPPH radical scavenging rates of different samples

在較低濃度時(shí)，樣液對(duì)DPPH·有很高的清除率，且清除效果與標(biāo)準(zhǔn)液的清除效果具有相似的上升變化趨勢(shì)，因此，樣液具有一定的抗氧化性能。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，樣液對(duì)于DPPH·的清除率的最大值為83.33%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)合乙醇回流熱提法探討提取介質(zhì)濃度、料液比、加熱時(shí)間、加熱溫度對(duì)黃酮提取工藝影響，并對(duì)毛冬青葉總黃酮的抗氧化性能做初步討論研究。由試驗(yàn)得出結(jié)論：毛冬青葉中含黃酮類抗氧化成分，且最佳浸提工藝要求下總黃酮提取率為15.08%。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，該總黃酮提取液對(duì)·OH與DPPH·的清除率分別達(dá)到45.96%和83.33%，具備一定的清除自由基作用。

毛冬青葉中的黃酮類化合物具有一定抗氧化性能。毛冬青是我國(guó)南方分布廣泛的林葉資源，其含有的黃酮類物質(zhì)在抗氧化性能方面具有很好的生物活性，為研發(fā)新藥提供了有利的開發(fā)條件，同時(shí)對(duì)于提高毛冬青的經(jīng)濟(jì)效益，充分利用毛冬青資源具有重要意義。