酶法消減花生漿中兩種主要過敏蛋白的研究

石振鵬，吳子健，*，劉敏堯，劉靚

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津?yàn)I海諾奧酶工程技術(shù)有限公司，天津300300）

花生不僅富含油脂（其脂肪含量約為45%～56%）， 還富含蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)含量為22%～30%）[1]，是生產(chǎn)食用油重要的原料，也是重要的食品原料、以及食品添加劑、風(fēng)味劑等，其已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人們?nèi)粘Ｊ称返纳a(chǎn)與加工中[2-4]。然而，攝食花生或含花生的食品會導(dǎo)致眾多花生過敏者嚴(yán)重甚至是致命的過敏反應(yīng)，由其誘發(fā)的過敏反應(yīng)為速發(fā)型，通常過敏者在攝入半小時后就會產(chǎn)生過敏，危害程度很高。2002年Bindslev-Jensen C等利用統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)牛奶、雞蛋和大豆粉引起過敏反應(yīng)的閾劑量（即1百萬過敏者發(fā)生1例過敏的食物劑量）分別為 0.005、0.002、0.001 3 mg，而花生粉僅為0.000 7 mg[3]。在美國，約0.8%的兒童以及0.6%的成年人對花生過敏[4]。而我國民眾食用花生的量不斷提高，因而花生過敏反應(yīng)的比例也在不斷增加。目前已知的花生過敏原（分別為Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7、Ara h8、Ara h9、Ara h10和Ara h11）是一類分子量在0.7 kDa～100 kDa的糖蛋白[5]，其中 Ara h1（63.5 kDa）和 Ara h2（16 kDa～17 kDa）是最主要的兩種，分別占花生總蛋白的12%～16%和5.9%～9.3%，90%的花生過敏癥患者對這兩種蛋白過敏[6]。2006年Kagan等研究表明約75%花生過敏反應(yīng)是由意外接觸引起的，進(jìn)而危及生命，占已報道與過敏相關(guān)死亡的59%[7]。因此消減花生、花生制品及其原料中過敏原至關(guān)重要，不僅可有效防止過敏，并且可以提高過敏者的生活質(zhì)量，更可保護(hù)過敏者的生命安全。

目前，消減花生過敏原的方法包括熱處理[8]、輻射處理[9]、酶法[10]以及基因工程法[11]。其中酶法是通過修飾或破壞花生抗原決定簇，進(jìn)而降低其過敏性，是目前較為有效且安全的處理方式。2007年叢艷君[12]研究發(fā)現(xiàn)脫殼烘烤后的花生中所提取的蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶Alcalase酶解，其花生蛋白致敏性降低了34.5%。2006年尤麗麗[13]研究發(fā)現(xiàn)利用胰蛋白酶水解可有效將花生乳的致敏性降低61.6%。

本文通過采用復(fù)合蛋白酶制劑消減花生過敏原性的方法，將預(yù)處理過的花生仁漿通過控制酶用量，酶解時的pH值，溫度以及時間來確定最佳消減花生過敏原性的工藝手法，消減情況通過雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附（enyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生：市售；食品級堿性蛋白酶（200 000 U/g）、中性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（8 000 000 U/g）和風(fēng)味酶（40 000 U/g）：天津諾奧酶科技發(fā)展有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒：北京百泰克生物技術(shù)有限公司；花生過敏原Ara h1酶聯(lián)免疫分析試劑盒、花生過敏原Ara h2酶聯(lián)免疫分析試劑盒：上海酶聯(lián)生物研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；試驗(yàn)所用超純水均為天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器和設(shè)備

3-18K低溫高速離心機(jī)：美國Sigma公司；KQ-500B超聲波清洗器：昆山市超聲波儀器有限公司；SpectraMax190光吸收酶標(biāo)儀：美國美谷分子儀器有限公司；UPT-11-20T超純水器：成都優(yōu)普超純科技有限公司；FiveEasy PlusTMpH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；FDU-810型EYELA冷凍干燥機(jī)：日本東京理化公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生仁漿的預(yù)處理

取100 g脫殼花生仁經(jīng)過研磨，加入100 mL蒸餾水打漿，然后沸水浴30 min，作為酶解底物。

1.3.2 復(fù)合酶酶解花生仁漿

將預(yù)處理好的花生仁漿中加入一定濃度的復(fù)合蛋白酶制劑溶液，調(diào)節(jié)其反應(yīng)pH值，置于已調(diào)至所需酶解溫度的恒溫水浴箱內(nèi)，酶解一定時間。然后提取蛋白并以ELISA法測定其過敏原性。

1.3.2.1 復(fù)合蛋白酶制劑的最佳配比優(yōu)化

參考相關(guān)資料[12-13]，初定酶解條件為酶用量2%，pH值7.0，酶解溫度55℃，酶解4 h。

選用堿性蛋白酶（Alcalase，A）、中性蛋白酶（Neutrase，N）、木瓜蛋白酶（Papain，P）、風(fēng)味酶（Flavorzyme，F(xiàn)）按照不同的體積比例的復(fù)合，其中以前3種酶為主。設(shè)置復(fù)配比例如下：

復(fù)合酶樣品 1：A∶N∶P∶F=2∶1∶1∶1；復(fù)合酶樣品 2：A∶N∶P∶F=1∶2∶1∶1；復(fù)合酶樣品 3：A∶N∶P∶F=1∶1∶2∶1；復(fù)合酶樣品 4：A∶N∶P∶F=2∶2∶1∶1；復(fù)合酶樣品 5：A∶N∶P∶F=2∶1∶2∶1；復(fù)合酶樣品 6：A∶N∶P∶F=1∶2∶2∶1；復(fù)合酶樣品 7：A∶N∶P∶F=2∶2∶2∶1。

1.3.2.2 酶用量的優(yōu)化

5份樣品的復(fù)合蛋白酶制劑用量分別為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。

1.3.2.3 pH值的優(yōu)化

5 份樣品的 pH 值參數(shù)分別為：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

1.3.2.4 酶解溫度的優(yōu)化

5 份樣品的溫度參數(shù)分別為：45、50、55、60、65 ℃。

1.3.2.5 酶解時間的優(yōu)化

5 份樣品的酶解時間參數(shù)分別為：3、3.5、4、4.5、5 h。

1.3.2.6 酶解正交試驗(yàn)

在以上條件下所測得結(jié)果中，選擇合適的參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)分析，確定最佳方案。

1.3.3 花生蛋白的提取

將花生仁漿冷凍干燥后按10 mL/g的比例加入正己烷，于4℃振蕩過夜脫脂，然后4℃離心（8 000 r/min，離心20 min），取沉淀凍干得脫脂花生粉。

參考Prakash等[14]的方法：將脫脂花生粉，按1∶20（g/mL）比例加入pH值為7.8的20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（含1 mol/L氯化鈉），4℃振蕩提取4 h，然后于4℃離心（14 000 r/min，離心10 min），取上清液，4℃透析（透析袋分子截留量為8 kDa～10 kDa）48 h之后凍藏備用。

1.3.4 蛋白濃度的測定

采用二辛可寧酸法（bicinchoninic acid，BCA）[15]測定花生蛋白溶液的濃度。

1.3.5 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）

使用Ara h1及Ara h2酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒測定兩種過敏原的濃度及消減情況，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合蛋白酶制劑的配比試驗(yàn)結(jié)果

堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)配使用進(jìn)行花生漿的酶解克服了花生過敏原對于單一酶的抑制作用。各種酶的降解底物存在差異，將幾種酶復(fù)配使用，各自的差異特性會產(chǎn)生協(xié)同增效作用，提高酶的催化活性。而添加風(fēng)味酶能有效的改善因蛋白降解而引起的味道不適，增加酶解后花生漿的口感。7種復(fù)合酶樣品酶解后Ara h1及Ara h2消減率變化如圖1所示。

圖1 復(fù)合蛋白酶比例對花生蛋白致敏性消減率的影響Fig.1 Effect of the ratio complex enzyme on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖1可知，樣品1～3為分別單獨(dú)增加前3種酶的用量是，花生致敏蛋白消減率的變化，此時致敏蛋白消減率為1＞2＞3，即堿性蛋白酶對致敏蛋白的消減作用強(qiáng)于中性蛋白酶及木瓜蛋白酶；由樣品4～6可知，同時增加兩種酶在復(fù)合酶中的配比，致敏蛋白消減效果最好的為樣品4，Areh1消減率為90.21%，Areh2消減率為88.33%；樣品7為增加了3種酶在復(fù)合酶的配比，Areh1消減率90.36%，Areh2消減率87.45%，與樣品4相比，復(fù)合酶制備成本增加，但效果提升不明顯，故選用A∶N∶P∶F=2∶2∶1∶1作為復(fù)合蛋白酶制劑的較優(yōu)配比。

2.2 復(fù)合蛋白酶制劑的酶解條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶用量對花生蛋白致敏性的影響

圖2為酶用量對酶解后Arah1及Arah2消減率變化的影響。

圖2 酶用量對花生蛋白致敏性消減率的影響Fig.2 Effect of the enzyme dosage on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖2可知，隨著酶用量的增加，花生致敏蛋白消減率呈增長趨勢，當(dāng)酶液濃度達(dá)到3%后，其消減花生蛋白過敏原性效果趨于平緩。這表明酶與底物的作用達(dá)到了平衡，繼續(xù)增加酶量造成了成本的浪費(fèi)。因此，選用3%為最適酶用量。

2.2.2 酶解pH值對花生蛋白致敏性的影響

復(fù)合蛋白酶制劑為多種酶的混合，需綜合考慮各種酶的適用pH值范圍，以確定最佳酶解條件。酶解pH值對Arah1及Arah2消減率變化的影響如圖3所示。

圖3 pH值對花生蛋白酶解致敏性消減率的影響Fig.3 Effect of the hydrolysis pH on the reducing allergenic property of peanut protein

pH值對復(fù)合蛋白酶制劑酶解花生蛋白的效率影響較大，由圖3可知，當(dāng)pH值為7.5時，花生致敏蛋白消減率最高，Ara h1消減率為90.96%，Ara h2消減率為88.33%，此時仍處于堿性蛋白酶，中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的最適pH值范圍內(nèi)，由于風(fēng)味酶的主要作用在于改善花生仁漿的風(fēng)味，且此pH值下風(fēng)味酶的活性保持較好，故可選取7.5為最適酶解pH值。

2.2.3 酶解溫度對花生蛋白致敏性的影響

酶解溫度的選擇與pH的選擇類似，酶解溫度對Ara h1及Ara h2消減率變化的影響如圖4所示。

圖4 酶解溫度對花生蛋白的致敏性的影響Fig.4 Effect of the hydrolysis temperature on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖4可知，在60℃時復(fù)合蛋白酶制劑消減花生過敏原性效果最好，Ara h1消減率91.22%，Ara h2消減率88.67%。此溫度下各種酶類仍能保持較高的活性狀態(tài)，且當(dāng)酶解溫度較高時，有利于花生中油脂與食物蛋白的擴(kuò)散，可以一定程度上加快酶解速度。這符合蘆鑫等[16]的解釋：最適酶解溫度實(shí)際上是溫度對酶活性和食物蛋白及油脂的擴(kuò)散度影響。故確定最適酶解溫度為60℃。

2.2.4 酶解時間對花生蛋白致敏性的影響

酶解時間對Ara h1及Ara h2消減率變化的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解時間對花生蛋白致敏性的影響Fig.5 Effect of the hydrolysis time on the reducing allergenic property of peanut protein

由圖5可知，酶解時間為4 h時，Ara h1消減率91.59%，Ara h2消減率89.15%，隨著時間的繼續(xù)增加，致敏蛋白消減率變化不是很大，考慮到時間成本，最適酶解時間為4 h。

2.3 復(fù)合蛋白酶制劑的酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用酶解時間、pH值、酶用量以及酶解溫度，以Ara h1和Ara h2的平均消減率為指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)表及極差分析結(jié)果如表1所示。

表1 復(fù)合蛋白酶制劑酶解正交試驗(yàn)及極差分析表Table 1 Orthogonal test and range analysis of enzymatic hydrolysis of compound enzyme

從正交試驗(yàn)驗(yàn)表得知9組試驗(yàn)中花生致敏蛋白消減率的較好方案為A3B1C3D2，由極差分析得出影響復(fù)合蛋白酶制劑酶解花生蛋白水解物致敏性的因素主次關(guān)系為C＞D＞B＞A，即花生致敏蛋白消減率最佳條件組合為A2B1C3D2，與較好方案不一致，因此需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 復(fù)合蛋白酶制劑酶解驗(yàn)證試驗(yàn)Table 2 Complex enzyme preparation enzymatic verification test

由表2可知A2B1C3D2為復(fù)合蛋白酶制劑消減花生致敏性蛋白的最佳條件，在此條件下通過ELISA試驗(yàn)計算得到Ara h1消減率94.06%，Ara h2消減率91.75%。上述試驗(yàn)僅以花生致敏蛋白中最主要的兩種Ara h1和Ara h2的消減率代表了花生致敏蛋白消減率，關(guān)于該種復(fù)合蛋白酶制劑對于其他非主要種類的致敏蛋白的消減率的測定需進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

3 結(jié)論

得到一種復(fù)合蛋白酶制劑可有效地消減花生仁漿中Ara h1和Ara h2，各種酶的配比為，堿性蛋白酶∶中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶∶風(fēng)味酶的體積比為 2∶2∶1∶1。正交試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)合蛋白酶制劑消減花生仁漿中Ara h1和Ara h2的水解條件：酶用量4%，酶解溫度60℃，pH值7.0，酶解時間4 h。在該條件下處理所得的花生仁漿中的致敏蛋白Ara h1和Ara h2的平均消減率為92.91%