桂花提取物對雄性果蠅抗氧化及抗衰老作用的研究

劉冀婕，黃玲艷，曾照準，孫霽寒，王虹懿，彭景

（揚州大學食品科學與工程學院，江蘇揚州225127）

桂花（Osmanthus fragrans Lour．）又名木樨、金栗、九里香，為木犀科屬植物，是我國十大傳統(tǒng)花卉之一。桂花不僅是著名的觀賞及芳香植物，也是重要是食用及藥用植物。目前關于桂花的研究多集中于芳香物質、提取工藝以及體外抗氧化活性。已有研究發(fā)現(xiàn)[1]，桂花中蘊藏著豐富的蛋白質、氨基酸、維生素和黃酮類化合物。楊秀蓮等研究證實不同品種桂花間的營養(yǎng)成分差別很大[2]，國內外均有研究報道桂花的各種化合物的提取工藝以及抗氧化活性，主要集中在黃酮類、多酚和多糖[3-5]，現(xiàn)已普遍認為桂花具有降血糖、清除自由基、抗氧化、抗炎等作用。由此可推斷桂花可能有延長壽命、抗衰老的作用。

衰老是人類生活的一個自然生理過程，受復雜的調節(jié)系統(tǒng)控制，其特點是細胞和組織功能逐漸衰退。關于衰老的機理，以Harman[6]提出的自由基學說最具有代表性。機體會通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產生氧自由基，氧自由基通過多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，產生大量代謝產物丙二醛（malondialdehyde，MDA），可引起細胞代謝及功能障礙，加速機體衰老。但機體存在直接清除自由基，抑制自由基的生成或是激活機體抗氧化體系的自由基清除劑，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（catalase，CAT）等酶類清除劑。

果蠅生命周期短，成本低，且具有與人類十分相似的衰老基因[7]，因此常被作為研究延緩衰老和抗氧化的生物模型。本文以雄性Oregon K野生型紅眼黑腹果蠅為生物模型，研究桂花提取物的抗氧化作用及其對果蠅壽命的影響，為進一步開發(fā)利用桂花提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與試劑、設備

1.1.1 實驗動物

Oregon K野生型紅眼黑腹果蠅：溫州大學生命與環(huán)境科學學院提供。

1.1.2 實驗材料

桂花提取物：參照李姝[8]的方法，略有改動，金桂花采摘陰干后置于烘干箱中，50℃烘干，粉碎，過40目篩。取金桂花粉末200 g，按料液比1∶8（g/mL）加入80%乙醇，浸泡14 h后在50℃水浴條件下回流浸提3 h，濾渣重復提取3次，合并萃取液，萃取液用旋轉蒸發(fā)儀40℃，-0.1 MPa減壓濃縮，0.22 μm過濾器過濾除菌，得浸膏即桂花醇提物，桂花醇提物的成分主要為多酚類化合物、黃酮和多糖。補充無水乙醇使桂花醇提物總質量為100 g，則該1 g桂花提取物相當于2 g金桂花的有效成分，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實驗試劑

無水乙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：上海蘇懿化學試劑有限公司；乙醚：上海蘇懿化學試劑有限公司；葡萄糖：天津致遠化學試劑有限公司；對羥基苯甲酸乙酯、瓊脂粉：國藥集團化學試劑有限公司；玉米粉：市售；酵母粉：安琪酵母股份有限公司；總蛋白（total protein，TP）試劑盒、過氧化氫酶試劑盒、丙二醛試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒：南京建成生物工程有限公司。

1.1.4 儀器設備

BS22九陽料理機：九陽股份有限公司；BS224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；DK-S28電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；VPH11-5T超純水儀：四川優(yōu)普超純科技有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、RE-52B旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HSX-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O備有限公司；SX-500快速自動高壓滅菌器：上海珂淮儀器有限公司；Allegra X-22R臺式冷凍離心機：美國Benckman Coulter公司；Vortex-Genie2旋渦混勻器：美國Scientific Industries公司；Spectrumlab755s可見分光光度計：上海棱光技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

基礎培養(yǎng)基：參照王彥平等[9]的配方，蒸餾水750 mL、酵母 10 g、葡萄糖 72 g、玉米粉 72 g、瓊脂 6 g、75%乙醇水溶液40 mL（含1%對羥基苯甲酸乙酯）；分別用蒸餾水溶解玉米粉、葡萄糖、瓊脂粉、酵母粉，葡萄糖和瓊脂粉溶解后加熱至沸騰，加入已溶的玉米糊和乙醇水溶液，不斷攪拌至黏稠，沸騰后暫停加熱，加入溶解的酵母粉，攬拌均勻，冷卻前用注射器將其分裝到培養(yǎng)管，每管大約2 mL。

試驗培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中，添加2.5、5、10、15 mg/mL桂花提取物，配制成不同濃度的試驗培養(yǎng)基。

1.2.2 果蠅的生存實驗

收集2 d齡雄性果蠅成蟲1 000只，隨機分為對照組、桂花提取物劑量組（2.5、5、10、15 mg/mL）共 5組，每組5管，每管40只，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)[溫度（25±0.5）℃，濕度（60±5）%]，每 4天更換一次培養(yǎng)基并記錄果蠅的死亡數量至全部死亡。計算平均壽命、最高壽命[10]和延壽率[11]，延壽率/%=（處理組平均壽命-對照組平均壽命）/對照組平均壽命×100，并繪制生存曲線。

1.2.3 桂花提取物對應激條件下果蠅壽命的影響

1.2.3.1 急性氧化損傷實驗

果蠅分組與培養(yǎng)同生存實驗。參考文獻[9]的方法。養(yǎng)至第25天后，饑餓2 h，用CO2麻醉后導入無培養(yǎng)基的干凈試管中，將沾有含30%H2O2的6%葡萄糖水溶液的濾紙條放入試管，每4小時記錄果蠅死亡數目，直至全部死亡，并繪制生存曲線。

1.2.3.2 SDS急性損傷實驗

果蠅分組與培養(yǎng)同生存實驗。參考文獻[12]。養(yǎng)至第25天后，饑餓2h，均給予6%葡萄糖溶液（含6mg/mL SDS），每4小時記錄死亡數至全部死亡，繪制生存曲線。

1.2.3.3 果蠅的熱應激損傷實驗

果蠅分組與培養(yǎng)同生存實驗。參考文獻[13]。第25天齡時放入（35±1）℃培養(yǎng)箱，每4小時記錄其死亡數至全部死亡，繪制生存曲線。

1.2.4 果蠅體內氧化指標的測定

收集2 000只2 d齡雄性果蠅成蟲，隨機分為對照組、桂花提取物劑量組（2.5、5、10、15 mg/mL）共 5 組，每組10管，每管40只，培養(yǎng)方法同生存實驗。在第25天和第45天時，將果蠅饑餓處理2 h，每組用CO2麻醉5管，稱重。按照果蠅體重1∶49（mg/mL）的比例加入生理鹽水，冰浴勻漿，2 500 r/min，4℃離心15 min，吸取上清，取上清液按試劑盒說明測定果蠅體內血清總蛋白含量（mg/mL）、總超氧化物歧化酶、Cu，Zn-SOD活性（U/mL）、CAT活性（U/mL）和MDA含量（nmol/mL）。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 桂花提取物對果蠅壽命的影響

桂花提取物對果蠅壽命的影響見表1，果蠅生存曲線見圖1。

表1 桂花提取物對果蠅壽命的影響Table 1 Effect of Osmanthus extract on drosophila melanogaster lifespan

圖1 果蠅生存曲線Fig.1 Drosophila melanogaster survival curve

由表1可知，與對照組相比，桂花提取物劑量組果蠅的平均壽命和最高壽命均有所增長，延壽率分別為3.28%、3.43%、13.58%、20.83%，其中 10、15 mg/mL劑量組平均壽命的差異極其顯著（P＜0.01），5 mg/mL劑量組最高壽命有顯著差異（P＜0.05），10、15 mg/mL劑量組最高壽命的差異極顯著（P＜0.01）。

由圖1可看出，36天齡后，各組存活率明顯下降，但各劑量組存活率均高于對照組。另外，與對照組相比，隨著桂花提取物劑量的增加，果蠅生存曲線逐漸發(fā)生右移。

2.2 桂花提取物對果蠅體內TP含量的影響

桂花提取物對果蠅體內血清總蛋白含量的影響見表2。

由表2可知，空白對照組在45 d齡時的體內TP含量低于25 d齡的果蠅體內TP含量，而各劑量組果蠅體內TP含量均高于25 d齡的果蠅。在25 d齡時，與空白對照組相比，各劑量組雄性果蠅體內TP含量無顯著差異（P＞0.05）；在45 d齡時，與空白對照組相比，劑量組均能提高果蠅體內TP含量，15 mg/mL劑量組能顯著提高果蠅體內 TP 含量（P＜0.05），但 2.5、5、10 mg/mL劑量組TP含量無顯著差異（P＞0.05）。

表2 桂花提取物對果蠅體內血清總蛋白含量的影響Table 2 Effect of Osmanthus extract on TP content in drosophila melanogaster

2.3 桂花提取物對果蠅SOD活性的影響

桂花提取物對果蠅超氧化物歧化酶活性的影響見表3。

表3 桂花提取物對果蠅超氧化物歧化酶活性的影響Table 3 Effect of Osmanthus extract on SOD activity in drosophila melanogaster

由表3可知，對照組和劑量組果蠅在45 d齡時體內T-SOD活性均比25 d齡時高。與對照組相比，25 d齡時，劑量組均能提高果蠅體內T-SOD活性，其中2.5 mg/mL劑量組果蠅體內T-SOD活性明顯提高，差異顯著（P＜0.05），5、10、15 mg/mL 劑量組果蠅 T-SOD顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。45 d齡時，與對照組相比，各劑量組果蠅體內T-SOD活性均顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。

由表3可知，空白對照組和2.5 mg/mL劑量組果蠅體內的Cu，Zn-SOD活性在45 d齡時較25 d齡略有下降。5、10、15 mg/mL劑量組的果蠅在45 d齡的Cu，Zn-SOD活性較25 d齡均略有提高。與對照組相比，25 d齡時，劑量組均能提高果蠅體內T-SOD活性，其中5、10、15 mg/mL劑量組果蠅Cu，Zn-SOD顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。45 d齡時，與對照組相比，各劑量組果蠅體內Cu，Zn-SOD活性均有所提高，其中5、10、15 mg/mL 劑量組果蠅 Cu，Zn-SOD 顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。

2.4 桂花提取物對果蠅CAT活性的影響

桂花提取物對果蠅體內CAT活性的影響見表4。

表4 桂花提取物對果蠅體內過氧化氫酶活性的影響Table 4 Effect of Osmanthus extract on CAT activity in drosophila melanogaster

由表4可知，空白對照組果蠅體內的CAT活性在45 d齡時較25 d齡略有下降，而各劑量組果蠅體內CAT活性在45d齡時較25d齡均有所提高。與對照組相比，在25 d齡時，2.5 mg/mL和5 mg/mL劑量組果蠅的CAT 活性略有提高，但差異不顯著（P＞0.05）；10 mg/mL和15 mg/mL劑量組果蠅的CAT活性明顯提高（P＜0.05）；在45 d齡時，與空白對照組相比，各劑量組果蠅的CAT活性極顯著提高，差異極其顯著（P＜0.01）。

2.5 桂花提取物對果蠅MDA含量的影響

桂花提取物對果蠅體內MDA含量的影響見表5。

表5 桂花提取物對果蠅體內丙二醛含量的影響Table 5 Effect of Osmanthus extract on MDA content in drosophila melanogaster

由表5可知，空白對照組和各劑量組果蠅體內的MDA含量在45 d齡時較25 d齡均略有提高。其中，在25 d齡時，與空白對照組相比，2.5 mg/mL劑量組果蠅體內的MDA含量略有下降，但差異不顯著（P＞0.05）；5 mg/mL劑量組果蠅體內的MDA含量明顯下降，差異顯著（P＜0.05），10 mg/mL和15 mg/mL劑量組果蠅體內的MDA含量顯著下降，差異極其顯著（P＜0.01）；在45 d齡時，與空白對照組相比，2.5、5 mg/mL劑量組果蠅體內的MDA含量略有下降，但差異不顯著（P＞0.05），10 mg/mL劑量組果蠅體內的MDA含量明顯下降，差異顯著（P＜0.05），15 mg/mL劑量組果蠅體內的MDA含量顯著下降，差異極其顯著（P＜0.01）。

2.6 桂花提取物對急性氧化損傷果蠅壽命的影響

桂花提取物對急性氧化損傷果蠅壽命的影響見表6。

由表6可知，與對照組相比，各劑量組均能延長急性氧化損傷果蠅的平均壽命和最高壽命。其中，除2.5 mg/mL劑量組外，各劑量組均極其顯著提高了平均壽命（P＜0.01）。5 mg/mL劑量組明顯提高了最高壽命（P＜0.05），其余劑量組極其顯著（P＜0.01）。

表6 桂花提取物對急性氧化損傷果蠅壽命的影響Table 6 Effect of Osmanthus extract on lifespan of derophila melanogaster in·OH acute experiment

2.7 桂花提取物對SDS急性損傷果蠅壽命的影響

桂花提取物對SDS急性損傷果蠅壽命的影響見表7。

表7 桂花提取物對SDS急性損傷果蠅壽命的影響Table 7 Effect of Osmanthus extract on lifespan of derophila melanogaster in SDS acute experiment

由表7可知，與對照組相比，各劑量組均能延長SDS急性損傷果蠅的平均壽命，但除15 mg/mL劑量組能極顯著提高果蠅平均壽命外（P＜0.01），其余劑量組差異均不顯著（P＞0.05）。與對照組相比，各劑量組均能延長SDS急性損傷果蠅的最高壽命，其中10、15 mg/mL劑量組能極顯著提高果蠅最高壽命（P＜0.01），5 mg/mL 劑量組能明顯提高（P＜0.05），2.5 mg/mL差異不顯著（P＞0.05）。

2.8 桂花提取物對熱應激損傷果蠅壽命的影響

桂花提取物對熱應激損傷果蠅壽命的影響見表8。

表8 桂花提取物對熱應激損傷果蠅壽命的影響Table 8 Effect of Osmanthus extract on lifespan of derophila melanogaster in acute experiment of heat temperature

由表8可知，桂花提取物各劑量組均能延長熱應激損傷果蠅的平均壽命和最高壽命。其中，與對照組相比，10、15 mg/mL劑量組極其顯著地延長了平均壽命的（P＜0.01），2.5 mg/mL劑量組延長了平均壽命，差異具有顯著性（P＜0.05），2.5、5 mg/mL 和 15 mg/mL 劑量組能顯著延長最高壽命（P＜0.05）。

3 結論與討論

正常情況下，機體通過產生和清除自由基維持機體的正常生理功能，使生物體保持平衡。但是機體隨著年齡的增長，新陳代謝異常，出現(xiàn)各種代謝綜合征[14]，使自由基大量產生，氧化和抗氧化平衡狀態(tài)受到破壞，使機體處于氧化應激狀態(tài)，機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著密切聯(lián)系，因此本研究不僅設計了壽命試驗，同時測定了果蠅體內SOD、CAT的活性以及MDA的含量。

通過實驗結果可以看出，桂花提取物不同劑量組均能不同程度延長果蠅的平均壽命和最高壽命，尤其是10、15 mg/mL劑量組效果最為顯著（P＜0.01）。桂花提取物10、15 mg/mL劑量組能顯著增加25 d齡果蠅體內CAT活性（P＜0.05），所有劑量組能極顯著增加45 d 齡果蠅體內 CAT 活性（P＜0.01），5、10、15 mg/mL劑量組能極顯著增加25 d齡和45 d齡果蠅體內SOD活性（P＜0.01），桂花提取物通過增加SOD、CAT活性從而提升果蠅自身的抗氧化能力。另外，由實驗可知，10、15 mg/mL劑量組能極顯著降低25 d齡果蠅體內MDA含量（P＜0.01），15 mg/mL劑量組能極顯著降低45 d齡果蠅體內MDA含量（P＜0.01），說明桂花提取物能在不同程度上降低果蠅體內MDA的含量，具有抑制MDA對機體組織造成損傷的作用，可以減輕機體氧化應激的水平，延緩衰老。

除了新陳代謝異常外，機體在一些應激狀態(tài)下也會導致自由基異常增多，從而加速機體的衰老與死亡。本研究設計了急性氧化損傷模型、SDS損傷模型、熱應激損傷模型3個應激損傷模型，實驗結果表明桂花提取物也能延緩應激狀態(tài)下果蠅的壽命，而10、15 mg/mL劑量組與對照組的差異極為顯著（P＜0.01）。

中醫(yī)理論中提倡“藥食同源”，使功效與安全性兼得，是開發(fā)抗衰老保健食品的良好來源[15]。本研究結果表明桂花具有極顯著的抗氧化、延緩衰老的作用，是繼人參、枸杞等目前研究較多的可食性中藥后又一可開發(fā)的抗衰老產品。為之后研究桂花對免疫功能的影響，明確其抗衰老活性機制，進一步開發(fā)利用桂花提供參考。