肺炎克雷伯菌果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)EⅡC編碼基因frwC缺失株的構(gòu)建及表型分析

林迪斯，徐 麗，李飛雨，汪靜杰，李 蓓

(湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北十堰 442000)

肺炎克雷伯菌 (Klebsiellapneumoniae, KP)是存在于人體上呼吸道和腸道的正常菌群，可引起呼吸道、泌尿道、傷口等部位的感染，是社區(qū)獲得性感染的常見菌株[1-2]。KP包含78個血清型，過去20年由KP強毒型(主要為K1、K2血清型)引起的感染如肝膿腫在全球已被證明，其死亡率可達10%～30%[3]。20世紀(jì)60年代，磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system, PTS系統(tǒng))第1次在大腸桿菌中作為糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)被提出，已在越來越多的細菌中被找到[4]。根據(jù)利用的糖類不同，PTS系統(tǒng)可分為10余種。作為一種復(fù)雜的蛋白激酶系統(tǒng)，PTS系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)各種各樣的功能運輸、代謝和誘變過程及許多基因的表達[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KP纖維二糖PTS系統(tǒng)中EⅡC蛋白編碼基因celB敲除株的玻片培養(yǎng)粘附作用不佳，不能完成生物膜形成完整過程，并且小鼠生存率增加12.5%～87.5%[7]。通過對KP NTUH-K2044全基因組分析發(fā)現(xiàn)，在KP中存在一個果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(KP1_1987-KP1_1993)。環(huán)磷酸腺苷受體蛋白(cAMP receptor protein, CRP)能夠直接調(diào)控此系統(tǒng)中編碼EII C蛋白的基因frwC的表達，而CRP基因缺失株細菌生長速度減慢、毒力明顯下降[8-9]。在此過程中，CRP是否可以通過調(diào)控frwC的表達而影響細菌的生長與毒力？本研究通過構(gòu)建frwC的缺失突變株與回補株，分析frwC對KP的生長、超黏表型、毒力的影響，從而明確CRP是否能夠通過調(diào)控frwC的表達而影響其表型。

1 材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒KP NTUH-K2044分離于肝膿腫患者，為K1血清型超黏表型，已全基因組測序。大腸桿菌DH5α及自殺質(zhì)粒pKO3-km、km-pGEM-T easy質(zhì)粒為本室保存。

1.2主要試劑ExTaq酶、Pfu酶、內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；細菌RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；RNase-Free DNase試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；結(jié)晶紫為Sigma公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母粉為OXOID公司產(chǎn)品；NaCl、瓊脂粉購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；卡那霉素購自晶美公司；氨芐青霉素鈉鹽(Amp)、硫酸慶大霉素(Cn)和5%綿羊血平板購自武漢天源生物技術(shù)有限公司；引物均由上海生工合成。所用引物見表1。

1.3frwC基因缺失株的構(gòu)建以KP1_1992-A/B和KP1_1992-C/D引物對分別進行frwC基因的上、下游同源臂擴增。以擴增產(chǎn)物為模板，利用融合PCR將上下游同源臂連接，形成敲除元件。以限制性內(nèi)切酶NotⅠ對融合的PCR片段和載體pKO3-km分別進行酶切，T4 DNA連接酶連接酶切產(chǎn)物，獲得敲除用的重組質(zhì)粒frwC-pKO3-km。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入NTUH-K2044感受態(tài)細胞，涂布LB平板(含50 μg/mL kan)，30 ℃培養(yǎng)過夜。采用pKO3-km-F/R引物對鑒定已有質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的陽性克隆，挑選3～5個鑒定正確的陽性單菌落，涂LB(50 μg/mL kan)平板上，43 ℃培養(yǎng)至平板上長出單菌落。采用KP1_1992_A/D引物對PCR擴增，篩選出產(chǎn)物明顯小于陽性對照(KP野生株DNA為模板)的單菌落，再將此菌落接種于含蔗糖的LD平板上，挑取生長菌落，以KP1_1992-RT-F/R引物對鑒定為陰性的克隆即為KPfrwC基因的無痕缺失突變株[10]。

表1擴增所用引物列表

Tab.1 Primers used in this study

目的引物名稱序列(5′→3′)構(gòu)建frwC的缺失突變株KP1_1992-AGTATGCGGCCGCGTTATCGCGGCGAATGCCTCAKP1_1992-BTGACGCAGGCAGCGCTGATGCTTGCTCCTGAGCGCTGKP1_1992-CCAGCGCTCAGGAGCAAGCATCAGCGCTGCCTGCGTCAKP1_1992-DGTATGCGGCCGCGATTCGTCATGATAAACTC構(gòu)建frwC的回補株KP1_1992-FGAGTCCATGGTGATAAGCAGCTGGCAGGCKP1_1992-RGAGTGTCGACATCGCTGATATTGACGCGCpGEM-T-easy質(zhì)粒鑒定pGEM-T-easy-km-FGCGAATTGGGCCCGACGTCpGEM-T-easy-km-RCGCAGCCGAACGACCGAGpKO3-km質(zhì)粒鑒定pKO3-km-FAATAAGCGGATGAATGGCAGpKO3-km-RTCCCTCACTTTCTGGCTGGfrwC基因RT-PCR鑒定KP1_1992-RT-FGACACAGCCCATCACCAGKP1_1992-RT-RTGCCTACGCCTTCATGCT16sRNA基因RT-PCR擴增KP1_16sRNA-RT-FATGACCAGCCACACTGGAACKP1_16sRNA-RT-RCTTCCTCCCCGCTGAAAGTAmagA基因RT-PCR引物KP1_magA-RT-FCGAAAGTGAACGAATTGATGCTKP1_magA-RT-RGTTTCTGCTGCAGATTCGAAGA

劃線部分為酶切位點。NcoⅠ酶切：CCATGG ；SalⅠ酶切：GTCGAC ；NotⅠ酶切：GCGGCCGC。

1.4frwC基因回補株的構(gòu)建擴增包含frwC基因編碼區(qū)、上游啟動區(qū)及下游轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的基因片段，克隆至km-pGEM-T easy獲得回補用的重組質(zhì)粒frwC-km-pGEM-T easy，電轉(zhuǎn)化至frwC敲除株獲得frwC回補株C-frwC。

1.5frwC基因缺失株與回補株RT-PCR驗證將野生株、frwC突變株、回補株37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至平臺期，稀釋至A600=1.2后按1∶100的比例稀釋至新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min培養(yǎng)至A=1.4，取菌液各1 mL于無菌EP管內(nèi)，4 ℃ 5 000×g離心10 min，通過RNeasyR Mini kit試劑盒提取細菌RNA，RNase-Free DNase試劑盒去除DNA污染，M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，16sRNA為內(nèi)參基因利用frwCRT-PCR鑒定引物進行PCR擴增，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6frwC基因?qū)毦L速度的影響不同菌株接種于3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min培養(yǎng)過夜，調(diào)整A600值約1.2后，100倍稀釋接種至15 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min連續(xù)培養(yǎng)，間隔1 h取菌液測A600值，繪制生長曲線，分析不同菌株的生長速度。

1.7frwC基因?qū)毦玖Φ挠绊懖煌暝贚B培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期，離心收集細菌。用PBS洗滌后，104CFUs腹腔注射感染Balb/c小鼠(10只/組)，觀察記錄動物的死亡情況，繪制小鼠生存曲線。

1.8frwC基因?qū)毦け硇偷挠绊懖煌杲臃N于3 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜，調(diào)整A600至1.2，1∶100稀釋接種于15 mL培養(yǎng)至A6001.4～1.6。各取1 mL菌液，10 000×g離心3 min，觀察細菌沉淀情況。

1.9RT-PCR檢測frwC對細菌超黏相關(guān)基因magA的影響不同菌株37 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)，稀釋A600至1.2后，按1∶100的比例接種LB培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min培養(yǎng)至A600=1.4，取菌液各1 mL于無菌EP管內(nèi)4 ℃ 5 000×g離心10 min，提取細菌RNA，16sRNA為內(nèi)參基因，分析不同菌株超黏相關(guān)基因magA的表達情況。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的組間差別多重比較LSD法檢驗3組細菌的生長情況；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1成功構(gòu)建frwC缺失突變盒成功獲得frwC基因上游581 bp及下游534 bp的同源臂。再以上下游同源臂片段的PCR產(chǎn)物作為模板，用引物對KP1_1992-A/D進行PCR擴增，得到長度為1 097 bp的frwC基因同源臂融合片段。同時，以野生株作為陽性對照，可得到2 028 bp的片段。PCR結(jié)果如圖1所示。PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期值一致，PCR產(chǎn)物送至上海生工測序，測序結(jié)果與基因序列一致。

圖1同源臂及融合片段擴增PCR產(chǎn)物

Fig.1 The PCR identification results of fusion fragments

M：DL2000 marker；1：frwC上游同源臂片段；3：frwC下游同源臂片段；5：融合PCR產(chǎn)物；7：野生株AD長度；2、4、6、8：陰性對照。

2.2frwC缺失株的篩選及確認(rèn)將構(gòu)建好的frwC突變盒電轉(zhuǎn)至野生株中，經(jīng)過2次同源重組，獲得frwC缺失突變株。分別以KP1_1992-A/B、KP1_1992-C/D、KP1_1992-A/D、KP1_1992-RT-F/R引物對進行鑒定。野生株中AD長度為2 028 bp，敲除株中為1 097 bp；野生株中frwC基因為陽性，突變株中frwC基因為陰性，各引物擴增PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期值一致(圖2)。

圖2frwC缺失株P(guān)CR鑒定結(jié)果

Fig.2 The PCR identification results offrwCdepletion mutant

M：DL2000 marker；1、2、3：引物對為KP1_1992-A/B；4、5、6：引物對為KP1_1992-C/D；7、8、9：引物對為KP1_1992-A/D；10、11、12：引物對為KP1_1992-RT-F/R；1、4、7、10：模板為野生株；2、5、8、11：模板為突變株；3、6、9、12：陰性對照。

2.3frwC基因缺失株與回補株RT-PCR驗證提取野生株、frwC缺失株及回補株的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以16sRNA為內(nèi)參，KP1_1992-RT-F/R引物對擴增，分析不同菌株中frwC基因mRNA表達情況。如圖3所示，RT-PCR在野生株與回補株中能夠檢測到frwC基因的表達，而突變株中無frwC基因表達，說明突變株中frwC基因被成功敲除，回補株中frwC基因成功回補。

圖3KP野生株、frwC基因缺失株及回補株RT-PCR鑒定

Fig.3 The RT-PCR identification results ofKlebsiellapneumoniae NTUH-K2044frwCdepletion mutant and complementation strain

2.4frwC基因影響細菌生長速度繪制不同菌株在LB中的生長曲線(圖4)，通過重復(fù)測量數(shù)據(jù)的組間差別多重比較LSD法檢驗發(fā)現(xiàn)，野生株與回補株的生長曲線差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.791)，敲除株與野生株生長曲線有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此，敲除株生長速度與野生株相比明顯減慢。

圖4KP野生株、frwC基因缺失株與回補株的生長曲線

Fig.4 Growth curve ofKlebsiellapneumoniae NTUH-K2044,ΔfrwCand C-frwC

2.5frwC基因敲除株小鼠實驗毒力減弱我們通過小鼠腹腔感染模型分析frwC基因缺失后對KP毒力的影響，在104CFU濃度下，Kaplan-Meier法檢驗frwc敲除株與野生株生存率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)，frwC基因缺失株的存活率相對野生株明顯增加(圖5)，說明frwC基因敲除株的小鼠毒力明顯下降。

圖5KP野生株、frwC基因缺失株與回補株小鼠存活率

Fig.5 Mouse survival ofKlebsiellapneumoniae NTUH-K2044,ΔfrwCand C-frwC

2.6frwC基因敲除株黏性增強如圖6A所示，10 000×g離心3 min后，野生株與回補株聚集在管底，而敲除株細菌呈云霧狀分散于EP管下端。隨后RT-PCR檢測超黏基因magA表達發(fā)現(xiàn)，敲除株的表達量多于野生株與回補株，frwC基因敲除株黏性增強。

圖6超黏表型實驗

Fig.6 Biosynthesis test of capsular polysaccharide

A：離心實驗；B：RT-PCR。

3 討 論

1964年，KUNDIG等[4]發(fā)現(xiàn)了磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，提出PTS可能會催化糖轉(zhuǎn)運及糖磷酸化。PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)由EI、HPr與EⅡ(一般包含3或4個結(jié)構(gòu)域A、B、C或D)三類蛋白質(zhì)構(gòu)成。其中EⅡC一般位于細胞膜上，能特異識別糖并將其轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，因此決定了PTS系統(tǒng)糖轉(zhuǎn)運的特異性[5,11-12]。且越來越多的證據(jù)表明，PTS已經(jīng)不只是參與糖類的代謝轉(zhuǎn)運，還存在很多不同的種類，例如，李斯特菌中主要的毒力調(diào)控子PrfA的活性與PTS系統(tǒng)組件的磷酸化狀態(tài)相關(guān)[13]；在布魯氏菌毒力相關(guān)基因的篩選中發(fā)現(xiàn)，PTS相關(guān)基因ptsN和ptsH缺失導(dǎo)致細菌毒力減弱[14]。

在對于KP的研究中，有研究發(fā)現(xiàn)，敲除編碼纖維二糖酶Ⅱ(EⅡC)特異性亞基ⅡC的celB基因后，缺失株的的生物膜形成能力及細菌毒力均低于野生株[7]。除纖維二糖PTS系統(tǒng)外，KP還有10多種PTS系統(tǒng)。其中KP1-1987-KP1-1993基因編碼果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)。

本課題組在研究CRP蛋白對KP的毒力影響及機制中發(fā)現(xiàn)，CRP能夠直接調(diào)控果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)EⅡC蛋白編碼基因frwC的合成。在創(chuàng)傷弧菌中，毒力因子vIDE的表達由CRP蛋白和葡萄糖PTS系統(tǒng)共同作用[15]。那么在KP中CRP是否通過調(diào)節(jié)frwC的表達來影響細菌生長、超黏表型及毒力，frwC是否與細菌的致病性相關(guān)？本研究通過構(gòu)建frwC基因的缺失株及回補株分析frwC基因在KP生長、超黏表型及毒力中的作用。通過細菌生長曲線實驗證明frwC基因影響細菌生長速度；通過離心實驗發(fā)現(xiàn)frwC基因敲除株的超黏性升高；超黏基因magA表達量檢測與離心實驗結(jié)果相符，說明frwC敲除后細菌黏性增強；小鼠毒力實驗發(fā)現(xiàn)frwC也與毒力密切相關(guān)，frwC基因敲除株細菌毒力明顯下降。

通過研究發(fā)現(xiàn)，frwC作為果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)EIIC的編碼基因，能夠影響細菌的生長、超黏表型及毒力。因此，果糖PTS系統(tǒng)不僅參與了糖類的利用，它還能影響細菌的其他功能。crp基因缺失突變株同樣毒力、生長速度下降，而且超黏性增加，說明CRP除調(diào)控細菌莢膜、菌毛等毒力因子外，還能通過影響frwC的表達而調(diào)控細菌毒力。