調(diào)脂通脈中藥對動脈粥樣硬化兔模型內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的影響

張 璐 孫 晴 郭書文 鄭 敏 蘇兆鐸 武建功 劉文臣 陳 曦

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；3.中日友好醫(yī)院，北京 100029；4.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

動脈粥樣硬化（AS）病變斑塊的易損性是引起心腦血管急性事件的主要原因，“罪犯病變”一詞很好地描述了易損斑塊的特征。AS斑塊中主要病理特征是“脂質(zhì)核心”，在病理因素刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞表達(dá)多種模式識別受體（PRRs）［1］，巨噬細(xì)胞通過這些 PRRs（如清道夫受體）特異性的攝取ox-LDL，ox-LDL沉積，凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1（LOX1）激活，釋放炎癥因子，引起趨化因子MCP-1表達(dá)，趨化單核細(xì)胞，形成泡沫細(xì)胞，最終形成脂質(zhì)核心［2］?？梢?，動脈內(nèi)膜損傷是AS病變發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。調(diào)脂通脈中藥由黃芪、當(dāng)歸、決明子、生山楂、澤瀉、地龍、三七粉組成，來源于臨床經(jīng)驗方，用于治療血脂異常，效果明顯。本實驗采用高脂飼料飲食加球囊損傷頸動脈內(nèi)膜的方法復(fù)制兔動脈粥樣硬化模型，通過觀察內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物內(nèi)皮素（ET-1）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、前列環(huán)素 2（PGI2）、血栓烷 A2（TXA2），探討調(diào)脂通脈中藥改善AS的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新西蘭大耳兔，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，3～4月齡，雄性，購自北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，許可證編號SCXK（京）2010-0001，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部普通動物實驗室。飼養(yǎng)條件符合國家二級標(biāo)準(zhǔn)，單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、水。

1.2 實驗藥物 調(diào)脂通脈中藥，組成：決明子、生山楂各 30 g，生黃芪 20 g，澤瀉 12 g，當(dāng)歸、地龍各 15 g，三七粉6 g，共128 g。嚴(yán)格遵循口服顆粒劑制備工藝，按處方比例稱取藥材，前6味中藥加水煎煮2次，濃縮制成稠膏，將三七粉按比例加入上述稠膏，混勻，制成整粒，干燥，包裝，制成每劑20 g的顆粒（由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院提供）。按人體質(zhì)量70 kg折算成兔等效劑量：7.3 g/（kg·d）。 阿托伐他汀鈣片（立普妥，輝瑞制藥有限公司提供，生產(chǎn)批號：1237304，規(guī)格20 mg/片），按臨床 20 mg/d 折算，兔等效劑量為 1.1 mg/（kg·d）。

1.3 動物飼料 高脂飼料（膽固醇1%，豬油3%，蛋黃粉10%，普通飼料86%）購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號：SCXK（京）2009-0008。實驗兔每只每日給予120 g高脂飼料，其余為普通飼料。

1.4 試劑與儀器 烏拉坦，500 g/瓶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司提供。肝素鈉注射液，2 mL/支：12500 IU，由常州千紅生化制藥有限公司提供。鹽酸利多卡因注射液，5 mL∶0.1 g/支，上海朝暉藥業(yè)。注射用青霉素鉀（獸用），北京立時達(dá)藥業(yè)，160萬IU/支。ELISA試劑盒，武漢華美生物工程有限公司提供。2.0 mm×15 mm球囊導(dǎo)管，德國貝朗公司提供。球囊擴(kuò)張壓力泵，BMW指引導(dǎo)絲，Y閥三通管，備皮刀，臨時動脈夾，眼科剪，眼科鑷，止血鉗（蚊式和普通），持針器，無菌帶線縫合針，不同規(guī)格的注射器。全自動生物化學(xué)分析儀，型號7600，日本日立公司；全封閉式組織脫水機(jī)，型號ASP300S，德國 Leica；石蠟組織包埋系統(tǒng)，型號 EG1150，德國Leica；手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，型號RM2235，德國Leica；H&E自動染色機(jī)，型號ST5020，德國Leica；全波長多功能酶標(biāo)儀，型號22051164，瑞士Tecan。

1.5 模型制備 高脂飼料喂養(yǎng)2周后采用球囊損傷頸動脈方法復(fù)制AS模型［3-4］。術(shù)前12 h禁食，不禁水。稱體質(zhì)量，給予25%烏拉坦注射液4 g/kg耳緣靜脈注射，麻醉成功標(biāo)志：呼吸深慢均勻，四肢癱軟，角膜反射遲鈍。麻醉成功后耳緣靜脈推注肝素鈉200 IU/kg，防止凝血。動物仰臥位固定于無菌手術(shù)臺，電推剪脫毛，常規(guī)外科消毒，鋪巾，沿頸正中線切開頸部皮膚，暴露皮下組織，縱行逐層鈍性分離肌肉、筋膜，分離頸動脈血管，保護(hù)伴行的神經(jīng)，區(qū)分頸總動脈、頸內(nèi)動脈以及頸外動脈后，應(yīng)用動脈夾結(jié)扎頸總動脈和頸內(nèi)動脈，眼科剪斜向頸外動脈剪一“V”型小口，將2.5 mm×15 mm球囊經(jīng)頸外動脈送入頸總動脈至主動脈弓處，給予合適壓力，重復(fù)操作3～4次，隨后抽空球囊，緩慢撤出導(dǎo)管，無菌縫合線結(jié)扎頸外動脈，撤出動脈夾恢復(fù)血流。檢查有無出血、滲血，逐層縫合肌肉、皮層。應(yīng)用800000 IU青霉素肌肉注射3d預(yù)防感染。假手術(shù)組僅在解剖出頸總動脈后，用無菌縫合線在頸外動脈（遠(yuǎn)心端處）打一死結(jié)，不進(jìn)行球囊損傷。術(shù)后將動物置于加熱毯上，無菌敷料覆蓋。造模后繼續(xù)高脂飼養(yǎng)。

1.6 分組與給藥 隨機(jī)化原則分為正常組、假手術(shù)組、模型組、西藥組和中藥組，每組14只，在造模成功后第6周、第12周兩個時間點觀察指標(biāo)變化情況。術(shù)后灌胃相應(yīng)藥物，中藥組予調(diào)脂通脈中藥7.3 g/kg（顆粒劑用沸水溶成湯劑）；西藥組予阿托伐他汀1.1 mg/kg（研磨后0.9%氯化鈉注射液溶解）；正常組、假手術(shù)組和模型組不進(jìn)行藥物干預(yù)，以相同體積蒸餾水灌胃；各組均為4 mL/kg，每日1次。

1.7 標(biāo)本采集與檢測 1）血脂測定。分別在造模后6周和12周2個時間點將兔空腹禁食12 h，不禁水后，耳緣靜脈采血，3000 r/min，離心10 min，留取血清。全自動生物化學(xué)分析儀測定血清膽固醇（TC）、三酰甘油（TAG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，計算動脈粥樣硬化指數(shù)（AI），AI=（TC-HDL-C）/HDL-C。 2）頸動脈病理組織觀察。在造模后6周和12周兩個時間點將實驗兔沿耳緣靜脈注入10mL空氣處死。剪開頸部皮膚，剝離肌肉組織，暴露頸動脈，剪取盡可能長的頸總動脈。將頸總動脈用生理鹽水反復(fù)沖洗后固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。3）肝臟病理組織觀察。取各組實驗在造模后6周和12周兩個時間點取肝臟標(biāo)本，將肝臟組織固定于10%甲醛中，石蠟包埋，切片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固，封片后顯微鏡觀察，拍照，傳入病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。 4）ET-1、eNOS、PGI2、TXA2 水平檢測。用ELISA試劑盒檢測血液中ET-1、eNOS、PGI2、TXA2水平，按試劑盒上的說明進(jìn)行操作，觀察第6周、12周指標(biāo)變化情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組動脈粥樣硬化兔模型血脂水平比較 見表1。與正常組比較，模型組TC、LDL-C水平明顯升高，高脂血癥較為明顯（AI＞4）。西藥組和中藥組TC水平較模型組降低（P＜0.05）。LDL-C與TC變化趨勢相似，兩個藥物組的水平在不同時間點均較模型組降低（P＜0.05）。中藥組和西藥組之間未發(fā)現(xiàn)TC和LDL-C水平顯著差異，兩組TAG差異不顯著。此外中藥組和西藥組在12周時升高HDL-C水平（P＜0.05）。計算動脈粥樣硬化指數(shù)（AI），中藥組在12周時表現(xiàn)出最佳降低高脂血癥的效果（AI＜4），有效降低動脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險。

表1 各組血脂水平比較（x±s）

2.2 各組頸總動脈斑塊大小評價 見圖1。顯微鏡下觀察頸總動脈切片HE染色結(jié)果，如圖所示正常組頸總動脈結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜無增厚，內(nèi)皮下未見AS病變斑塊；中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊。模型組可見管腔狹窄，AS斑塊向管腔內(nèi)突起，管腔完整性被破壞，內(nèi)皮細(xì)胞受損，可見泡沫細(xì)胞組成的脂質(zhì)斑塊。與模型組比，治療組內(nèi)皮細(xì)胞層緊密排列，連續(xù)性佳，平滑肌細(xì)胞未見增殖重構(gòu)，提示治療有效。12周時，模型組頸動脈斑塊幾乎布滿整個管腔，管腔狹窄，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，可見典型的脂質(zhì)斑塊形成。斑塊底部肌層萎縮變薄。與模型組比較，兩個給藥組實驗兔的AS病變斑塊得到了不同程度的控制，中藥組和西藥組僅見少量斑塊，病變較輕。

2.3 各組肝臟形態(tài)學(xué)改變比較 見圖2。6周時，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰中央靜脈居中，界面平滑，肝索排列規(guī)則，胞核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞未見增生。高脂飲食喂養(yǎng)下的模型組肝臟組織中脂質(zhì)積聚情況較正常組和假手術(shù)組增多。與模型組比較，中藥組和西藥組肝臟的脂質(zhì)積聚情況明顯減輕。12周時，模型組可見彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞甚至炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞體積明顯增加，胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂肪空泡，核被擠于細(xì)胞邊緣。中藥組肝細(xì)胞一定程度損壞，可見散在肝細(xì)胞脂肪變性，以小空泡脂肪變?yōu)橹?，肝小葉內(nèi)少許炎細(xì)胞浸潤，未見肝內(nèi)炎癥現(xiàn)象，脂滴明顯減少。少數(shù)可見有肝細(xì)胞碎屑樣壞死和炎細(xì)胞浸潤，但未見有纖維化改變。

圖1 各組頸總動脈切片（HE染色，200倍）

圖2 各組肝臟病理組織（HE染色，40倍）

2.4 血清內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物 ET-1、eNOS、PGI2、TXA2水平 見表2。6周時，與假手術(shù)組比較，模型組兔血清ET-1、TXA2 含量明顯升高，eNOS、PGI2 水平下降（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組和西藥組ET-1、TXA2含量下降，eNOS、PGI2 水平升高（P＜0.05）。12 周時，與假手術(shù)組比較，模型組兔血清內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物ET-1、TXA2含量分別升高了60.21%和 52.73%（P＜0.05），eNOS、PGI2水平下降了 55.61%和 42.83%（P＜0.05），提示模型組后期內(nèi)皮損傷嚴(yán)重。與模型組比較，中藥組的 eNOS、PGI2水平升高了 58.16%和 31.73%（P＜0.05），ET-1、TXA2水平下降了 41.82%和 21.96%（P＜0.05），提示調(diào)脂通脈中藥能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷。同時，西藥組也起到了相同的作用。

表 2 各組血清 ET-1、eNOS、PGI2、TXA2 水平比較（ng/L，x±s）

3 討 論

正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞通過產(chǎn)生血管活性物質(zhì)、生長因子、生長抑制因子維持血管壁的穩(wěn)態(tài)［5］。如位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的TXA2和進(jìn)入血流的PGI2、一氧化氮（NO），它們相互拮抗、相互協(xié)調(diào)，具有抗血栓形成、介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞舒縮功能的作用［6］。NO是體內(nèi)L-精氨酸在一氧化氮合酶（NOS）的催化下形成的，是十分重要的信使分子。NOS分為eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），eNOS會在血管內(nèi)產(chǎn)生NO與其協(xié)助調(diào)節(jié)血管功能，可與原生膜所包圍的細(xì)胞及與細(xì)胞內(nèi)高基氏體膜聯(lián)合，是誘導(dǎo)NO生成重要的酶［7］。ET-1是一種由21個氨基酸殘基組成的活性多肽，是目前所知最強的縮血管物質(zhì)［8］。內(nèi)皮細(xì)胞損傷，可表現(xiàn)為血管舒張-收縮功能失衡，即NO水平降低和ET-1分泌增加，出現(xiàn)通透性和分泌功能障礙，甚至內(nèi)皮剝脫［9］。此外，TXA2和PGI2，作為花生四烯酸代謝產(chǎn)物中生物活性最強的一對，分泌失衡也是發(fā)生AS的始動環(huán)節(jié)，因其參與了激活血小板，使血小板聚集和血管擴(kuò)張［10］。內(nèi)皮損傷，活性氧簇（ROS）增加，肌質(zhì)網(wǎng)鈣三磷酸腺苷酶氧化增強，穩(wěn)態(tài)失衡，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、代謝功能失調(diào)、自由基形成等多重反應(yīng)［11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，6周、12周兩個時間點，動脈粥樣硬化兔模型血液中eNOS、PGI2表達(dá)下降，ET-1、TXA2水平升高，表明AS模型出現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙，而兔模型通過調(diào)脂通脈中藥干預(yù)后，能夠降低ET-1、TXA2水平，同時升高 eNOS、PGI2水平，改善了內(nèi)皮細(xì)胞收縮-舒張功能障礙。因此，我們推測調(diào)脂通脈中藥能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷，保護(hù)血液和組織之間的這層“屏障”。

“膏脂學(xué)說”是中醫(yī)認(rèn)識本病的重要依據(jù)?！鹅`樞·衛(wèi)氣失常》中提到“眾人血與氣不能相多，膏者多氣，氣者多熱；脂者，其血清，氣滑少”。可見氣血理論在本病治療中具有指導(dǎo)意義。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“人以脾胃為本，蓋人受水谷之氣以生”。脾是淋巴器官，具有重要的免疫功能。脾氣虛會造成血脂異常，這是一個多臟腑功能失調(diào)作用的結(jié)果，脾系統(tǒng)的功能不僅僅局限于西醫(yī)解剖學(xué)中的脾臟，還涉及消化系統(tǒng)、血液、免疫、神經(jīng)功能等。因此，脾氣虛可使免疫系統(tǒng)功能下降，而這也正是引起動脈粥樣硬化形成的重要因素之一。

在多臟腑功能失調(diào)中，最重要的是脾氣虛會影響肝的疏泄功能，肝失疏泄使膽汁聚集，形成結(jié)石阻滯膽道。膽道受阻會降低凈濁化脂的功能，進(jìn)而引起血脂異常。氣血關(guān)系密切自不必說，氣為血帥，血隨氣行。肝失疏泄引起氣滯不行或脾氣虛推動無力，會引起血瘀。脾虛不運清濁，津液停滯，濕邪內(nèi)聚而致痰生?！杜R證指南醫(yī)案》中說“濕為重濁有質(zhì)之邪，若從外而受者，皆由地中之氣升騰；若由內(nèi)而生者，皆由脾陽之不足”?？梢姖裥芭c脾虛關(guān)系密切。濕性黏滯，阻礙氣機(jī)，化而為痰。明代王絕在《明醫(yī)雜著》中所言“痰者，病名也，人之一身，氣血清順則津液流通，何痰之有？唯氣血濁逆，則津液不清，熏蒸成聚而變?yōu)樘笛伞薄！毒霸廊珪ぬ碉嫛分幸蔡岬健疤导慈酥蛞?，無非水谷之所化。此痰亦既化之物，而非不化之屬也。但化得其正，則形體強，營衛(wèi)充，而痰涎本皆血氣；若化失其正，則臟腑病，津液敗，而血氣即成痰涎”。氣虛、血瘀、痰濁，會引起血液流變異常，血流不暢使血液呈黏滯、濃稠狀態(tài)，引起血脂增高。所以痰濁凝聚、結(jié)于心脈亦是動脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵病機(jī)。

從現(xiàn)代藥理學(xué)角度看，血脂異常會引起血漿成分發(fā)生改變，如血小板、ET-1，動脈收縮，血管內(nèi)正常的代謝受到抑制，引起脂質(zhì)沉積［12］。筆者認(rèn)為，動脈粥樣硬化的治療關(guān)鍵是健脾益氣為本，以去濁活血通絡(luò)為標(biāo)。以此為依據(jù)遴選組成的中藥復(fù)方——調(diào)脂通脈中藥，標(biāo)本兼治，臨床長期療效較好，課題組前期實驗研究驗證其作用效果明顯，能夠降低AS模型血清炎癥因子、增加抗炎因子如IL-10、TGF-β的表達(dá)，還能增加ApoE-/-小鼠斑塊內(nèi)自噬基因的表達(dá)［13-15］。本實驗對AS兔模型內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物eNOS、ET-1等藥效指標(biāo)進(jìn)行評價，研究表明調(diào)脂通脈中藥作用明顯，能夠起到降低血脂、改善內(nèi)皮功能紊亂的作用，為AS的預(yù)防和治療提供新的思路。