基質(zhì)金屬蛋白酶的研究進(jìn)展*

劉明明， 李愛玲， 修瑞娟

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所， 衛(wèi)生部微循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是自然界進(jìn)化中高度保守的一類蛋白酶，屬鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的幾乎所有成分及髓磷脂、生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附分子等[1]。ECM通過釋放信號(hào)分子為組成機(jī)體的重要細(xì)胞單位和組織單元提供結(jié)構(gòu)支撐。細(xì)胞和組織與ECM之間的相互作用可參與并影響機(jī)體大多數(shù)生理活動(dòng)[2]。正常生理情況下，MMPs表達(dá)水平極低，而在炎性因子、生長因子、高糖和氧化應(yīng)激等環(huán)境及病理?xiàng)l件下MMPs表達(dá)水平顯著上調(diào)。因此，MMPs在ECM和組織重構(gòu)、器官發(fā)生發(fā)育、血管形成、免疫炎癥、細(xì)胞遷移、增殖和細(xì)胞凋亡等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。近年隨著對(duì)MMPs基礎(chǔ)研究的不斷深入，其在諸多疾病進(jìn)程中的作用越來越受到臨床和基礎(chǔ)領(lǐng)域?qū)W者的重視。

1 MMPs的結(jié)構(gòu)、分類和功能

1.1MMPs的結(jié)構(gòu) 人體內(nèi)表達(dá)25種MMPs，包括5個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域：信號(hào)肽(～20氨基酸)和前肽(～80氨基酸)、催化結(jié)構(gòu)域(～170氨基酸)和血紅素結(jié)合蛋白樣C末端結(jié)構(gòu)域(～200氨基酸)，后者通過鉸鏈區(qū)連結(jié)于催化結(jié)構(gòu)域。MMPs活性依賴于鋅離子(Zn2+)，其催化結(jié)構(gòu)域有2個(gè)Zn2+結(jié)合區(qū)和1個(gè)鈣離子(Ca2+)結(jié)合區(qū)，2個(gè)Zn2+結(jié)合區(qū)中，1個(gè)為催化性結(jié)合區(qū)，位于MMPs酶活性中心內(nèi)，通過保守序列HEXGHXXGXXH中組氨酸與Zn2+結(jié)合，參與MMPs催化過程；另1個(gè)為結(jié)構(gòu)性結(jié)合區(qū)[3]。信號(hào)肽可引導(dǎo)翻譯產(chǎn)物至胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。前肽含有保守的Pro-Arg-Cys-Gly-Val/Asn-Pro-Asp序列，其中的半胱氨酸殘基是MMPs酶原活化的關(guān)鍵位點(diǎn)，故前肽序列的裂解對(duì)于MMPs激活至關(guān)重要。鉸鏈區(qū)位于催化區(qū)和血紅素結(jié)合蛋白樣C末端結(jié)構(gòu)域之間，通過二硫鍵與血紅素結(jié)合蛋白區(qū)末端氨基酸殘基相連[4]，可能與MMPs激活過程中分子折疊有關(guān)，見圖1。血紅素結(jié)合蛋白樣C末端結(jié)構(gòu)域與MMPs底物特異性有關(guān)，同時(shí)參與MMPs與組織金屬蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)的結(jié)合。此外，部分MMPs家族成員存在弗林蛋白酶激活序列RRKKR，與該類MMPs酶原直接激活有關(guān)。

Figure 1.The structure of the matrix metalloproteinases.

圖1基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)示意圖

1.2MMPs的分類 根據(jù)底物的不同，MMPs可分為膠原酶(collagenases)，明膠酶(gelatinases)、間質(zhì)溶素(stromelysins)、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(membrane-type MMP，MT-MMP)和其它類型基質(zhì)金屬蛋白酶。MMPs酶分型、編號(hào)、全酶及活性酶分子量、主要酶分布及酶切底物見表1[5]。

表1 MMPs酶分型、編號(hào)、分子量、主要酶分布及底物

Table 1.(continued)

SMCs: smooth muscle cells； VSM: vascular smooth muscle； CA-MMP: cysteine array MMP.

1.3MMPs的功能 MMPs可在生理和病理?xiàng)l件下降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有主要成分，包括膠原、明膠、纖維蛋白和層黏連蛋白等。生理狀態(tài)下，MMPs可維持ECM正常結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)ECM降解、組織重建及細(xì)胞間多種可溶性因子的調(diào)控起重要作用，并參與機(jī)體血管生成、傷口愈合等諸多生理過程。此外，MMPs可參與內(nèi)皮細(xì)胞基底膜降解、遷移和增殖、新生血管、新生微血管和基底膜形成等過程；病理狀態(tài)下，MMPs參與腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移、心血管疾病和炎癥疾病的病理過程。腫瘤細(xì)胞可與基底膜表面受體纖維連接蛋白和層黏連蛋白結(jié)合，分泌MMPs或誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞分泌MMPs，降解基底膜的同時(shí)上調(diào)細(xì)胞外環(huán)境中血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子等水平，促進(jìn)腫瘤血管生長，導(dǎo)致腫瘤侵襲。此外，MMPs家族成員可活化ECM結(jié)構(gòu)蛋白，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。

2 MMPs的表達(dá)及活性調(diào)控

MMPs的表達(dá)和激活受到嚴(yán)格調(diào)控，包括基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)、蛋白酶原活化水平調(diào)控和特異性抑制因子TIMPs的調(diào)控，上述3個(gè)環(huán)節(jié)動(dòng)態(tài)維持機(jī)體MMPs穩(wěn)態(tài)。

2.1基因轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié) MMPs的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄水平，許多細(xì)胞因子、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)組分和化學(xué)因素(高糖毒性和激素等)均可誘導(dǎo)MMPs表達(dá)。糖皮質(zhì)激素和轉(zhuǎn)化生長因子β等則可在轉(zhuǎn)錄水平抑制MMPs基因表達(dá)。MMPs 5’-端基因序列存在1個(gè)約670個(gè)核苷酸組成的順式作用元件轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，包括TATA盒(TATA box)、激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、特化蛋白1、多瘤促活化因子(polymoma virus enhancer-3，PEA3)和激活蛋白2等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的結(jié)合位點(diǎn)，上述細(xì)胞因子、生長因子等通過反式作用因子激活MAPK等信號(hào)通路結(jié)合至AP-1和PEA3等調(diào)控元件位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)MMPs表達(dá)水平的調(diào)控。此外，轉(zhuǎn)錄因子可通過與MMPs啟動(dòng)子區(qū)的上述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合參與MMPs的表達(dá)調(diào)控[7]，如由c-Fos和c-Jun組成的轉(zhuǎn)錄激活因子異二聚體AP-1[8]和異?；罨腘F-κB[9]均參與了MMP-9的基因表達(dá)調(diào)控。同轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控一樣，轉(zhuǎn)錄后水平則主要通過調(diào)節(jié)MMPs的mRNA穩(wěn)定性，如Hu蛋白家族與3’-非翻譯區(qū)的富含A、U元件等抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合后可增加白細(xì)胞介素1β(interleukin-1 β，IL-1β)介導(dǎo)的MMP-9表達(dá)水平[10]。

2.2酶原活化水平調(diào)控 酶原活化過程是MMPs發(fā)揮其生物學(xué)功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，包括逐步活化機(jī)制、細(xì)胞表面活化和細(xì)胞內(nèi)活化途經(jīng)。絕大多數(shù)MMPs mRNA經(jīng)翻譯、修飾后以酶原形式(MMPs前體)分泌至細(xì)胞外基質(zhì)，經(jīng)絲氨酸蛋白酶、弗林蛋白酶等去除前肽區(qū)后活化。前肽區(qū)中PRCGV/NPD保守序列中，Cys-SH基與活性中心催化性Zn2+的結(jié)合是維持酶原穩(wěn)定的關(guān)鍵。Zn2+-Cys連接斷裂導(dǎo)致的活性中心游離是MMPs前體激活的關(guān)鍵。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(membrane type matrix metalloproteinase，MT-MMP)可通過其C末端的跨膜區(qū)定位于細(xì)胞表面，活化部分MMPs，如MT1-MMP，MT2-MMP，MT3-MMP和MT5-MMP均可活化pro-MMP-2；MT1-MMP可活化proMMP-13等[11]。一些MMPs(如MMP-3、 -11、 -21、 -28和MT-MMPs)含有弗林蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)[12]，可在細(xì)胞內(nèi)被弗林蛋白酶直接活化。

2.3TIMPs對(duì)MMPs的調(diào)節(jié)作用 TIMPs是MMPs的天然抑制物，是一組可抑制MMPs活性的多基因家族成員，包括TIMP-1～TIMP-4[13]，在調(diào)控MMPs活性方面發(fā)揮重要作用，見表2。TIMPs含有12個(gè)高度保守的半胱氨酸，在N端形成3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，半胱氨酸通過競爭性結(jié)合MMPs催化結(jié)構(gòu)域活性中心的Zn2+，抑制MMPs酶活性。在酶原活化階段，TIMPs可與MMPs形成穩(wěn)定的復(fù)合體，阻礙MMPs的酶原活化；對(duì)于活化的MMPs，TIMPs可與其形成復(fù)合物抑制其酶活性。TIMP-1主要由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成，可抑制絕大多數(shù)MMPs，廣泛存在于組織中，可被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生。TIMP-2是一種非糖基化蛋白，因與MMP-2有較強(qiáng)的親和力，故主要抑制MMP-2活性，對(duì)其它MMPs也有部分抑制作用。TIMP-3可抑制幾乎全部MMPs成員，僅存在于ECM中，是結(jié)合于ECM的非可溶性蛋白。TIMP-4屬于蛋白類抑制劑，在心臟表達(dá)水平較高，主要抑制MMP-2活性，阻止新生血管形成。

表2 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑的分子量、可溶性和底物

3 MMPs和疾病

正常表達(dá)水平的MMPs與生長發(fā)育過程中ECM重構(gòu)、細(xì)胞增殖、遷移和黏附等密切相關(guān)，參與調(diào)控機(jī)體多種生理過程。因此，MMPs表達(dá)譜發(fā)生改變、機(jī)體蛋白酶解和抗蛋白酶解平衡異常參與了包括心血管疾病、炎癥相關(guān)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤等疾病的發(fā)病機(jī)制和疾病進(jìn)程。

機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)和微循環(huán)系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地進(jìn)行血管和微血管結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，這一過程涉及MMPs基因表達(dá)和pro-MMPs活化的精確調(diào)控。在心血管疾病中，MMPs參與動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊破裂的病理進(jìn)程，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊纖維帽主要由膠原和彈性蛋白構(gòu)成，MMP-1、MMP-3和MMP-12參與粥樣斑塊成份的吸收和沉積過程，其表達(dá)水平異?？蓪?dǎo)致粥樣斑塊穩(wěn)定性下降[15]，甚至發(fā)生斑塊破裂。此外，動(dòng)脈粥樣硬化的疾病進(jìn)程發(fā)展與MMP-2和MMP-9介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移直接相關(guān)[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MMPs與心肌梗死[17-18]和心衰[19]的疾病進(jìn)展相關(guān)，可能和心肌病變部位局部炎癥因子的誘導(dǎo)MMP-2， -9表達(dá)上調(diào)有關(guān)。因此，有學(xué)者主張循環(huán)中可溶性MMPs可能成為心血管疾病診斷和預(yù)后判斷的分子之一。

機(jī)體炎癥狀態(tài)下，微循環(huán)中募集的免疫炎癥細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)通過分泌炎性因子和血管細(xì)胞黏附分子1等黏附至內(nèi)皮細(xì)胞表面，誘導(dǎo)其表達(dá)MMPs，促進(jìn)免疫炎癥細(xì)胞的跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移，同時(shí)增加MMPs(MMP-2和 -9)酶活性[20]。T細(xì)胞還可通過表面抗原CD40和內(nèi)皮細(xì)胞上的配體結(jié)合而激活，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMPs(MMP-1、MMP-3和MMP-9等)。炎癥相關(guān)疾病中，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜膠原的降解可能與關(guān)節(jié)滑膜中成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1和MMP-13有關(guān)[21]。MMP-7水平增加可通過IL-17參與慢性炎癥發(fā)生[22]。此外，炎癥介導(dǎo)的組織細(xì)胞壞死，組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)異常增多和過度沉積可導(dǎo)致纖維化發(fā)生，故MMPs可能參與了如特發(fā)性肺纖維化[23]等的疾病進(jìn)程。

MMPs在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的作用與其參與血管生成有關(guān)。由于腫瘤生長導(dǎo)致的局部相對(duì)缺血缺氧可上調(diào)MMPs表達(dá)水平(以MMP-9為著)。抑制MMPs可減輕缺血缺氧的損傷程度，同時(shí)抑制繼發(fā)性血管生成。文獻(xiàn)報(bào)道，MMP-2基因多態(tài)性與腫瘤微血管和淋巴管新生有關(guān)[24]；MMP-14活化可導(dǎo)致小鼠模型和臨床肝癌患者腫瘤生長和侵襲[25]；MMP-24可作為肺癌和胃癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記[26]；而MT1-MMP則與腫瘤細(xì)胞侵襲有關(guān)[27]。

腦組織ECM結(jié)構(gòu)完整是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。MMPs通過調(diào)節(jié)腦組織ECM重構(gòu)，參與了腦膜炎[28]、多發(fā)性硬化[29]和阿爾茲海默病[30-31]等疾病的發(fā)病機(jī)制。MMPs降解腦組織ECM的同時(shí)，部分MMPs(MMP-8和MMP-9)可抑制損傷后腦組織修復(fù)、破壞血腦屏障，導(dǎo)致腦血管和腦微血管源性水腫。

4 MMPs靶向藥物

ECM動(dòng)態(tài)重構(gòu)對(duì)于機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，ECM重構(gòu)過程發(fā)生異常時(shí)，可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此，MMPs可作為心血管、炎癥和腫瘤等疾病的臨床治療藥物靶點(diǎn)之一。MMPs參與維持機(jī)體正常生理功能(炎癥反應(yīng)和血管生成等)，MMPs廣譜抑制劑由于其不可避免的毒副作用在臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)欠佳[32]，篩選針對(duì)某一個(gè)MMP或某幾個(gè)MMPs的選擇性MMP抑制劑(包括抗體、抗體片段或小分子)成為MMPs靶向藥物需要考慮的問題之一。為解決上述毒副作用問題，有學(xué)者提出僅在必要時(shí)短時(shí)間沖擊給予MMPs廣譜抑制劑的應(yīng)用方案[33]。MMPs表達(dá)水平調(diào)控包括基因水平和酶原活化，因此，開發(fā)同時(shí)具有抑制MMPs基因表達(dá)和抑制MMPs酶活性的靶向藥物可能成為新的MMPs研究方向，如聯(lián)合納米探針-MMPs的生物工程新方案可實(shí)現(xiàn)對(duì)部分腫瘤組織MMPs的特異性抑制[34]。值得注意的是，并非所有MMPs均促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，一些MMPs家族成員對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用[35]。因此，精確界定特定腫瘤組織中不同MMPs的作用，在MMPs靶向藥物篩選中同樣至關(guān)重要。

目前所述，已有部分MMPs靶向藥物在基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)中展示出較好的疾病治療效果。MMP-9單克隆抗體GS-5745可使約45%的重度潰瘍性結(jié)腸炎患者獲益[36]，結(jié)腸炎癥得到控制；識(shí)別MMP-9第116位色氨酸至214位賴氨酸構(gòu)成的抗原表位的單克隆抗體REGA-3G12也已進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段[37]。氯毒素Chlorotoxin可選擇性抑制MMP-2，膠質(zhì)細(xì)胞瘤高表達(dá)MMP-2，因此其可能用于膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療[38]。選擇性MT1-MMP抑制劑DX-2400可抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的生長和代謝，同時(shí)增加其對(duì)放療的敏感性[39]。MMP-13選擇性抑制劑ALS-1-0635對(duì)急慢性關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨具有一定的保護(hù)作用[40]。上述以MMPs為藥物靶點(diǎn)的新藥物開發(fā)，將有助于為臨床實(shí)踐提供新的診療思路。

5 結(jié)語

綜上所述，MMPs參與機(jī)體多種生理和病理進(jìn)程，其作用模式和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不僅局限于降解ECM的蛋白水解酶范疇。MMPs在心血管疾病、炎癥相關(guān)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤中的作用已逐漸受到重視。闡明不同疾病中MMPs的表達(dá)水平及酶活性、同一疾病在不同疾病進(jìn)程時(shí)MMPs表達(dá)水平和酶活性有助于了解MMPs在上述疾病和疾病病理進(jìn)程中的作用機(jī)制。此外， 進(jìn)一步深入了解不同MMPs與其底物相互作用機(jī)制、MMPs和TIMPs間的平衡維持和失衡機(jī)制有助于開發(fā)新的MMPs靶向藥物(如非廣譜MMPs特異性抑制劑和選擇性MMPs單克隆抗體等)，并可能成為疾病治療新方案之一，具有一定的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)價(jià)值。