脫氫表雄酮對(duì)血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的改善作用*

李 靜， 白 玉， 張 鵬， 丁 瑞， 趙學(xué)梅

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2臨床藥理教研室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由于腦血管疾病所導(dǎo)致的腦實(shí)質(zhì)損傷而引起智能和認(rèn)知功能障礙的臨床綜合癥[1]。VD是我國(guó)老年癡呆的第二大致病因素，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)，已成為損害中老年人健康和生活質(zhì)量的常見病、多發(fā)病。血管性癡呆可導(dǎo)致空間認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶障礙。隨著我國(guó)人口老齡化的不斷發(fā)展及腦血管疾病(例如中風(fēng))發(fā)病率的逐年上升，血管性癡呆可能成為引起老年癡呆的首位原因。

脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是主要由腎上腺合成和分泌的一種性激素的前體物質(zhì)。DHEA也可在神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞中從頭合成，它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富、活性最強(qiáng)的一種神經(jīng)甾體激素。DHEA可以通過(guò)多種不同機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)調(diào)節(jié)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的作用，能夠延緩衰老，還能改善情緒。人體內(nèi)DHEA濃度于20歲左右達(dá)到峰值，然后逐年遞減，而DHEA濃度下降可能導(dǎo)致老年癡呆等老年病的發(fā)生。DHEA對(duì)老年癡呆疾病作用的研究多集中在對(duì)AD的研究。實(shí)驗(yàn)研究表明，DHEA可以改善Aβ癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，DHEA濃度降低與AD的發(fā)病率和Aβ在腦內(nèi)的沉積量正相關(guān)[2]。但是目前尚未查閱到DHEA對(duì)血管性癡呆的認(rèn)知及記憶能力影響的相關(guān)報(bào)道。本研究采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)缺血再灌注的方法，制作小鼠血管性癡呆模型，通過(guò)Y迷宮和新物體辨別行為學(xué)觀察及Western blot法檢測(cè)小鼠海馬組織神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen, NeuN)、突觸小泡蛋白(synaptophysin,SYP)和突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein-95, PSD-95)的含量，研究DHEA對(duì)血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)和記憶的作用，并探討其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

健康昆明小鼠40只，雄雌各半，體重18～22 g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(黑)2016-001。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

DHEA購(gòu)自Sigma；抗PSD-95抗體、抗SYP抗體和抗NeuN抗體購(gòu)自Proteintech；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和I抗、II抗去除液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所； II抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

3 主要方法

3.1動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)開始前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用BCCAO法構(gòu)建小鼠VD模型。將小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)(sham)組、模型(BCCAO)組、DHEA低劑量組(DEHA-low,20 mg/kg)、DHEA中劑量組(DHEA-middle,40 mg/kg)和DHEA高劑量組(DHEA-high,60 mg/kg)，每組8只小鼠。

3.2動(dòng)物模型建立 將小鼠用戊巴比妥鈉(15 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定于鼠板，充分暴露頸部皮膚，常規(guī)消毒。除假手術(shù)組外，每只小鼠均進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎15 min后再灌注。假手術(shù)組小鼠僅分離迷走神經(jīng)，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈[3]。

3.3給藥方法[4]DHEA用DMSO溶解后，再用植物油將其稀釋成終濃度為0.1%的DMSO。低、中、高劑量組小鼠在缺血再灌注后24 h給予DHEA一次性腹腔注射。假手術(shù)組和模型組小鼠腹腔注射等體積的植物油。

3.4Y迷宮實(shí)驗(yàn)[5]小鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)裝置由呈現(xiàn)Y字型的3個(gè)支臂組成，分別為A、B和C臂，每個(gè)支臂長(zhǎng)40 cm,高12 cm,底部寬5 cm,頂部寬10 cm。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入固定某臂的末端，容許其自由進(jìn)出3個(gè)臂。在5 min內(nèi)，記錄小鼠進(jìn)臂總次數(shù) N及進(jìn)臂順序。小鼠連續(xù)進(jìn)入3個(gè)不同的臂被定義為1次正確交替反應(yīng)，記錄正確交替反應(yīng)次數(shù)(number of alternation)，用自發(fā)交替反應(yīng)率(alternation beha-vior)反映小鼠空間工作記憶能力。計(jì)算公式為alternation behavior=number of alternation/(N-2)。

3.5新物體辨別實(shí)驗(yàn)[5]實(shí)驗(yàn)裝置是一個(gè)正方形盒子(長(zhǎng)45 cm，寬45 cm，高15 cm)。測(cè)試前2 d，將小鼠放入實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地中適應(yīng)環(huán)境5 min，每次1只，每日2次。測(cè)試當(dāng)日，將小鼠放入實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地內(nèi)允許其自由探索3 min，然后取出，再將2個(gè)相同的物體(A1、A2)分別放置于距場(chǎng)地邊緣15 cm處，2者間隔15 cm。將小鼠與兩物體等距離處面向壁放入場(chǎng)地中，分別記錄5 min內(nèi)探索兩物體的時(shí)間(tA1和tA2)。1 h后，將A2換成新物體B，將小鼠再次放入，分別記錄5 min內(nèi)探索兩物體的時(shí)間(tA1和tB)。24 h后，將物體B換成新物體C，將小鼠再次放入，分別記錄5 min內(nèi)探索兩物體的時(shí)間(tA1和tC)。分別計(jì)算對(duì)新物體的優(yōu)先指數(shù)及辨別系數(shù)。優(yōu)先指數(shù)計(jì)算公式為： preferential index (1 h)=tB/(tA1+tB)； preferential index (24 h)=tC/(tA1+tC)。辨別系數(shù)計(jì)算公式為：discrimination index (1 h)=(tB-tA1)/(tA1+tB)； discrimination index (24 h)=(tC-tA1)/(tA1+tC) 。

3.6Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將小鼠斷頭處死，置于冰盤中，暴露腦組織，用生理鹽水沖洗表面血跡，快速分離出海馬組織，-80 ℃保存。提取假手術(shù)組、模型組和DHEA中劑量組(行為學(xué)治療效果最為顯著)蛋白，蛋白定量后，加入上樣緩沖液，煮沸 5 min，分裝。用10%聚丙烯酰胺分離膠，4% 聚丙烯酰胺濃縮膠進(jìn)行電泳，將蛋白質(zhì)從 SDS-PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉，加 I 抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加 II 抗，室溫孵育2 h，顯影。用IPP軟件分析目的蛋白條帶的積分吸光度(integral absorbance，IA)，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料測(cè)定值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組之間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 DHEA對(duì)癡呆小鼠Y迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

實(shí)驗(yàn)顯示各組小鼠進(jìn)臂總次數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，提示DHEA對(duì)動(dòng)物大腦皮層無(wú)興奮性影響，見圖1A。與假手術(shù)組的小鼠相比，模型組小鼠自發(fā)交替反應(yīng)率顯著降低(P<0.01)；DHEA治療組可以顯著提高小鼠自發(fā)交替反應(yīng)率(P<0.05)，提示DHEA能夠顯著提高小鼠空間記憶能力，見圖1B。

Figure 1.Effects of DHEA on the number of arm entries (A) and alternation behavior (B) of the mice in Y-maze test. Mean±SD.n=8.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsBCCAO group.

圖1DHEA對(duì)Y迷宮實(shí)驗(yàn)中小鼠進(jìn)臂總次數(shù)和自發(fā)交替反應(yīng)率的影響

2 DHEA對(duì)癡呆小鼠新物體辨別實(shí)驗(yàn)影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)均顯著低于模型組小鼠(P<0.01);與模型組相比，DHEA組顯著提高小鼠在新物體辨別實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)，提示DHEA組小鼠對(duì)新物體辨別的記憶能力要強(qiáng)于模型組小鼠(P<0.01),見表1。

表1 DHEA對(duì)小鼠探索新物體能力的影響

##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsBCCAO group.

3 DHEA對(duì)血管性癡呆小鼠海馬組織NeuN、SYP和PSD-95蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組的NeuN、SYP和PSD-95蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，DHEA組的NeuN、SYP和PSD-95蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，提示DHEA能顯著減少缺血導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡，提高海馬突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，說(shuō)明DHEA可以減少神經(jīng)元的丟失，改善突觸的功能，見圖2。

Figure 2.Effects of DHEA on the protein expression of NeuN, PSD-95 and SYP in the hippocampus. Mean±SD.n=5.#P<0.05vssham group;*P<0.05vsBCCAO group.

圖2DHEA對(duì)海馬NeuN、PSD-95和SYP蛋白表達(dá)的作用

討 論

隨著我國(guó)老齡化速度的進(jìn)一步加快，血管性癡呆已成為老年癡呆的第二大致病因素。血管性癡呆是發(fā)生在腦血管病基礎(chǔ)之上，以記憶、認(rèn)知功能缺損為主，或伴有語(yǔ)言、視空間技能及人格或情感障礙的獲得性智能的損害。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，血管性癡呆可導(dǎo)致空間作業(yè)和認(rèn)知能力下降，表現(xiàn)出分辨的準(zhǔn)確性降低，出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙[6]。血管性癡呆已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康甚至是生命的重要疾病之一，雖然廣受關(guān)注，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)可以控制該病病程進(jìn)展的理想藥物。

DHEA是一種可在神經(jīng)系統(tǒng)中獨(dú)立合成的神經(jīng)甾體物質(zhì)，它在腦組織的含量高于其它組織，且腦中DHEA含量不受血清DHEA含量影響。DHEA具有多種作用，可改善情緒、認(rèn)知、記憶功能，具有防治神經(jīng)退行性疾病及精神疾病的前景。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎缺血再放開的方法，致小鼠全腦缺血再灌注損傷，構(gòu)建小鼠血管性癡呆模型。通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)考察DHEA對(duì)血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的改善作用及可能機(jī)制。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的種類不同，其考查學(xué)習(xí)記憶的種類也不同。Y迷宮實(shí)驗(yàn)考查動(dòng)物的工作記憶能力，而新物體辨別實(shí)驗(yàn)則考察動(dòng)物的行為辨別及記憶能力。通過(guò)Y迷宮實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠與假手術(shù)組相比，進(jìn)臂錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，DHEA能夠顯著減少血管性癡呆小鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤反應(yīng)次數(shù)，顯著增加自發(fā)交替反應(yīng)率。新物體辨別實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠的辨別系數(shù)和優(yōu)先指數(shù)顯著降低，DHEA顯著提高癡呆小鼠對(duì)新物體的辨別能力。以上結(jié)果均提示DHEA能夠改善血管癡呆模型小鼠的空間認(rèn)知、行為辨別及記憶能力。

神經(jīng)元損傷與死亡[7]，突觸的改變[8]是血管性癡呆發(fā)病的重要機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后，可引起海馬神經(jīng)元損傷及數(shù)量減少、殘存神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而引起突觸功能障礙[9]。NeuN被稱為神經(jīng)細(xì)胞特異抗原的標(biāo)志物，常作為檢測(cè)神經(jīng)元的指標(biāo)。通過(guò)Western blot對(duì)小鼠海馬區(qū)NeuN蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，DHEA組小鼠NeuN的表達(dá)水平顯著增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DHEA具有減少海馬神經(jīng)元丟失的作用。

突觸是神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系和信息傳遞者，是學(xué)習(xí)記憶形成的基礎(chǔ)，對(duì)代謝紊亂、能量缺乏高度敏感，腦缺血會(huì)造成突觸相關(guān)蛋白的丟失[10-11]。腦缺血-再灌注損傷導(dǎo)致的突觸傳遞障礙可能是導(dǎo)致血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶障礙的重要機(jī)制之一。海馬是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的部位，但同時(shí)也是最易受缺血因素影響的腦區(qū)之一。SYP是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的囊泡膜上的特異性鈣結(jié)合蛋白。SYP存在于突觸前的囊泡上，常把它作為突觸前的特異性標(biāo)志物。SYP在突觸囊泡的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，而且參與突觸囊泡的再循環(huán)和突觸發(fā)生。突觸素減少，說(shuō)明突觸囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低，傳遞性能下降[12]。研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能下降的抑郁癥小鼠其SYP在mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)，突觸重塑受到破壞[13]。PSD-95是突觸活性區(qū)突觸后膜下方與胞漿相連的致密物質(zhì)，而其中的PSD-95也稱作突觸相關(guān)蛋白90(synapse-associated protein 90，SAP-90)，是在谷氨酸能突觸后致密區(qū)的一類特殊蛋白質(zhì)，具有維持突觸正常結(jié)構(gòu)及突觸可塑性的作用，從而保證突觸信號(hào)正常傳遞[14-15]。PSD-95可介導(dǎo)逆行性信號(hào)傳遞，增加突觸前膜突觸素的表達(dá)，提高阿爾茨海默病大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[15]。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管性癡呆小鼠受損海馬的SYP和PSD-95表達(dá)，探討DHEA調(diào)控血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆小鼠海馬的SYP和PSD-95蛋白表達(dá)水平顯著下降，DHEA組可顯著提高SYP和PSD-95蛋白表達(dá)水平的表達(dá)。結(jié)果提示DHEA可能是通過(guò)調(diào)節(jié)海馬SYP和PSD-9的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)突觸功能，減輕血管性癡呆小鼠突觸損傷的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)DHEA具有改善血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶障礙的作用，而且上調(diào)NeuN、SYP和PSD-95的蛋白表達(dá)。提示其作用機(jī)制可能與減少神經(jīng)元的丟失，降低神經(jīng)元的突觸損傷，調(diào)節(jié)突觸功能有關(guān)。

為了進(jìn)一步研究DHEA對(duì)血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力的影響，探討其作用機(jī)制，下一步將從以下3個(gè)方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究：(1)進(jìn)行形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)(例如尼氏染色、免疫組化、電鏡等)，驗(yàn)證DHEA減少神經(jīng)元丟失和改善突觸可塑性的作用；同時(shí)可通過(guò)電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，從形態(tài)學(xué)觀察DHEA抑制VD小鼠海馬神經(jīng)元的丟失作用是否與其調(diào)節(jié)凋亡和自噬有關(guān)。(2)采用Western blot及免疫組化方法，考察DHEA能否具有調(diào)控VD小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2和cleaved caspase-3)和自噬的相關(guān)蛋白(beclin-1和LC3)表達(dá)的作用。(3)使用sigma-1R KO小鼠和sigma-1R的激動(dòng)劑及拮抗劑，研究其作用是否與激動(dòng)sigma-1R有關(guān)，并且研究其作用與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之間的關(guān)系。我們將通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)探究DHEA在血管性癡呆中的價(jià)值，為開發(fā)新的治療血管性癡呆藥物提供新的思路及理論基礎(chǔ)。