瑞舒伐他汀改善缺氧/復(fù)氧引起的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用*

王圓圓， 白 雅， 馬晨超， 郭 超， 秦 娜, 魏 東

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院， 西安 陜西 710032)

缺血再灌注損傷所致的血腦屏障完整性受損可引發(fā)繼發(fā)性的腦損傷，如明顯的腦水腫，甚至梗死后出血轉(zhuǎn)化等[1]。防止和減輕血腦屏障的完整性破壞是緩解腦梗死損傷的重要治療靶點(diǎn)之一[2]。血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)主要由內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞終足以及基底膜等結(jié)構(gòu)組成，其中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)及其緊密連接是外周血液與腦組織間的第一道屏障，對(duì)微血管血腦屏障的通透性變化起主要作用[3]。近年來，作為臨床二級(jí)預(yù)防的調(diào)脂藥物他汀，其非調(diào)脂作用(包括抗氧化損傷和抗炎等方面)備受關(guān)注，其中，2013年及2015年關(guān)于他汀藥物對(duì)缺血再灌注相應(yīng)的臨床試驗(yàn)研究，如靜脈溶栓急性期他汀類藥物對(duì)卒中患者預(yù)后的THRaST研究(Thrombolysis and Statins Study)均提示他汀有改善癥狀性出血的作用，但具體機(jī)制尚不明確[4-5]。目前BMECs體外培養(yǎng)模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于BBB的研究[6]。因此，本研究采用氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)再復(fù)氧(reoxygenation,R)的BMECs體外培養(yǎng)模型為研究對(duì)象，探討瑞舒伐他汀(rosuvastatin,Ros)對(duì)BMECs體外缺氧/復(fù)氧損傷的影響以推測(cè)缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

瑞舒伐他汀、DNA酶Ⅰ和Ⅱ型膠原酶購自上海西格瑪公司(純度>99.8%)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、羊血清封閉液和胰酶均購自GIBCO；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和ECM細(xì)胞培養(yǎng)基購自ScienCell；噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、Western blot制膠套裝及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；超敏發(fā)光液購自Millipore；兔抗小鼠CD34(血管內(nèi)皮標(biāo)記蛋白)、兔抗小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、兔抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、兔抗小鼠磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)、兔抗小鼠磷酸化核因子κB(phosphorylated nuclear factor kappa B，p-NF-κB)、兔抗小鼠磷酸化P38絲裂原活化蛋白激酶(p-P38)及兔抗小鼠cleaved caspase-3抗體均購自Cell signaling technology；兔抗小鼠MMP2及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體均購自Abcam; 熒光染料羧基熒光素二乙酸酯琥珀酰亞胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE)購自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

2 主要方法

2.1小鼠BMECs原代分離及鑒定 BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，雌性雄性均可，體重7～9 g，頸椎脫臼處死后消毒，取出全腦及分離腦皮層置于DMEM高糖完全培養(yǎng)液，使用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.1% Ⅱ型膠原酶(含20 μmol/L DNA酶I)37 ℃水浴孵育0.5 h。離心后去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心，去除中上層神經(jīng)組織及大血管，加入0.1%胰酶37 ℃水浴消化0.5 h，離心，去上清液，加入20%新生牛血清懸浮混勻后離心，吸出白黃色的層面即為純化的微血管段，加入DMEM培養(yǎng)基離心漂洗2次后去上清，加入內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(20% FBS，內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，1 g/L肝素鈉，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺)懸浮后接種于事先涂布明膠的10 cm一次性塑料培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，12～24 h后換液，隨后隔天換液。7～9 d時(shí)細(xì)胞可達(dá)到單層融合，用0.25%胰酶消化傳代，采用分次收集消化液，只收集前5 min消化脫落的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定，熒光顯微鏡下觀察BMECs的CD34表達(dá)。

2.2體外缺氧/復(fù)氧模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用OGD/R的方法模擬體外BMECs的缺氧再灌注損傷，即取3～4代生長(zhǎng)良好的BMECs用含有0.02% EDTA的0.25%胰酶消化,以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)板,培養(yǎng)至完全匯合生長(zhǎng)后，更換無糖的Hanks 平衡鹽溶液,放入含95% N2和5% CO2的 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h或6 h；復(fù)氧復(fù)糖時(shí)，更換內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對(duì)照組更換無血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；他汀組于缺氧前24 h加入瑞舒伐他汀(用生理鹽水配制成100 mmol/L濃度的母液，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度)。同時(shí)倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取200 μL BMECs懸液以每孔1×104的密度接種于96孔板，培養(yǎng)至完全匯合生長(zhǎng)后，隨機(jī)分組并按要求實(shí)施缺氧復(fù)氧處理后，棄上清，每孔加約20 μL MTT溶液(5 g/L，完全配液基配制)繼續(xù)孵育1 h，終止培養(yǎng)，小心吸孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO后，震蕩5 min，使結(jié)晶充分溶解，設(shè)置加入等體積培養(yǎng)基、不同濃度瑞舒伐他汀和MTT溶液，但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白組。酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm測(cè)定吸光度(A)值，每孔重復(fù)3次。細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

2.4CFDA-SE細(xì)胞增殖檢測(cè) CFDA-SE廣泛用于細(xì)胞追蹤和細(xì)胞增殖研究。CFDA-SE 很容易穿過完整的細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)酯酶會(huì)切斷乙酸基，產(chǎn)生發(fā)熒光的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)。用DMSO溶解成5 mmol/L的CFDA-SE儲(chǔ)存液，于-20 ℃避光保存。使用時(shí)，用氧糖剝奪培養(yǎng)液或完全培養(yǎng)基稀釋成5 μmol/L的工作液培養(yǎng)細(xì)胞后，并在488 nm的激發(fā)光下檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)改變，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目。

2.5免疫熒光染色檢測(cè)CD34陽性細(xì)胞及cleaved caspase-3的水平 制備各組細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定,正常羊血清封閉，室溫孵育，依次加兔抗小鼠CD34多克隆抗體(1∶100)和兔抗小鼠cleaved caspase-3多克隆抗體(1∶100)，4 ℃冰箱孵育過夜，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的羊抗兔II抗(1∶50)于37 ℃孵育1 h。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)進(jìn)行胞核復(fù)染15 min，甘油封片。設(shè)置陰性對(duì)照：磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)代替 I 抗,其余步驟同上。染色后熒光顯微鏡觀察，每組細(xì)胞隨機(jī)觀察6個(gè)視野，ImageJ圖像處理軟件作熒光強(qiáng)度分析，結(jié)果以平均吸光度值表示,其中cleaved caspase-3水平越高則平均吸光度值越大。

2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過處理后的各組細(xì)胞，棄去上清液, 用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS清洗2次，加入細(xì)胞裂解液，冰面上裂解30 min，12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清，通過蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。以10% SDS-PAGE分離, 半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉PVDF膜1 h后，分別加入相應(yīng)I抗檢測(cè)MMP2、MMP9、Bcl-2、Bax、p-P38、p-NF-κB及p-JNK蛋白水平(1∶1 000稀釋)，于4 ℃ 孵育過夜，分別用相應(yīng)的抗兔或鼠 II 抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，通過發(fā)光液發(fā)光顯色，成像儀獲取圖像。β-actin作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (mean±SEM)表示，以SPSS 17.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMECs鑒定及各組形態(tài)學(xué)變化

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)CD34(綠色熒光)表達(dá)陽性的細(xì)胞占所有細(xì)胞約90%以上，即為BMECs,見圖1A。

光鏡下觀察BMECs形態(tài)，對(duì)照組可見短梭形、多角形細(xì)胞，融合后呈緊密連接的鋪路石樣單層生長(zhǎng)，見圖1Ba;與對(duì)照組比較，OGD 3 h/R 24 h)和OGD 6 h/R 24 h組的細(xì)胞可見不同程度脫落，未脫落細(xì)胞變圓回縮，細(xì)胞間間隙增大,見圖1Bb、g；經(jīng)1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L及20 μmol/L瑞舒伐他汀預(yù)處理[7]，OGD 3 h/R 24 h組及OGD 6 h/R 24 h組的細(xì)胞形態(tài)均有不同程度改善，即細(xì)胞基本呈短梭形或多角形，融合的細(xì)胞呈緊密連接的鋪路石樣生長(zhǎng)，見圖1Bc～f、h～k。

Figure 1.Identification of BMECs and observation of their morphological changes (scale bar=100 μm). A: CD34 positive cells were examined using immunofluorescence staining; B: bright-field images of BMECs. a: control group; b: OGD 3 h/reoxygenation 24 h group; c～f: 1 μmol/L (c), 5 μmol/L (d), 10 μmol/L (e) and 20 μmol/L (f) rosuvastatin pretreatment and OGD 3 h/reoxygenation 24 h groups; g: OGD 6 h/reoxygenation 24 h group; h～k: 1 μmol/L (h), 5 μmol/L (i), 10 μmol/L (j) and 20 μmol/L (k) rosuvastatin pretreatment and OGD 6 h/reoxygenation 24 h groups.

圖1BMECs鑒定及各組形態(tài)學(xué)變化

2 各組細(xì)胞活力的比較

OGD 3 h/R 24 h組和OGD 6 h/R 24 h組的細(xì)胞活力分別為(81.0±2.3)%和(66.8±6.5)%，瑞舒伐他汀預(yù)保護(hù)處理組，自1 μmol/L至10 μmol/L瑞舒伐他汀對(duì)BMECs活力的改善作用呈現(xiàn)濃度依賴性，其中，10 μmol/L瑞舒伐他汀可顯著改善OGD 3 h/R 24 h組和OGD 6 h/R 24 h組的細(xì)胞活力(P<0.05)。見圖2。

Figure 2.The effects of rosuvastatin (Ros) on the viability of BMECs treated with OGD/ R were analyzed via MTT assay. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0 μmol/L Ros group.

圖2MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BMECs細(xì)胞活力

CFDA-SE細(xì)胞增殖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常情況下，細(xì)胞不會(huì)出現(xiàn)皺縮，培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞數(shù)量較檢測(cè)前的增加至(104.7±14.4)%；OGD 3 h/R 24 h組和OGD 6 h/R 24 h組的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的皺縮或脫落，復(fù)氧24 h后細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(復(fù)氧24 h細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與OGD后復(fù)氧前細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比值)顯著降低；10 μmol/L瑞舒伐他汀可顯著縮短細(xì)胞皺縮或脫落的程度，復(fù)氧24 h后細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均明顯增加(P<0.05)，見圖3。

3 瑞舒伐他汀對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的BMECs凋亡有改善作用

熒光顯微鏡檢測(cè)各區(qū)域內(nèi)細(xì)胞情況，通過DAPI熒光判斷細(xì)胞核位置及細(xì)胞數(shù)，比較cleaved caspase-3紅色免疫熒光凋亡顆粒，與對(duì)照組相比，OGD 3 h/R 24 h組和OGD 6 h/R 24 h組可見紅色免疫熒光陽性顆粒數(shù)上升；在加入瑞舒伐他汀干預(yù)各組，凋亡顆粒數(shù)均較OGD 3 h/R 24 h組和OGD 6 h/R 24 h組顯著降低(P<0.05),見圖4。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧損傷引起B(yǎng)MECs的Bcl-2/Bax表達(dá)較正常組減少，經(jīng)瑞舒伐他汀處理的BMECs 組，Bcl-2/Bax升高(P<0.05),見圖5。提示瑞舒伐他汀通過抑制cleaved caspase-3,并上調(diào)Bcl-2/Bax，從而降低BMECs凋亡。

4 瑞舒伐他汀對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的BMECs中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比, OGD 3 h/R 24 h組和OGD 6 h/R 24 h組的MMP-9表達(dá)均顯著增加(P<0.05);與缺氧/復(fù)氧組相比較，10 μmol/l瑞舒伐他汀預(yù)處理可顯著降低MMP-9的表達(dá)水平，但與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；同時(shí)，缺氧/復(fù)氧后，與對(duì)照組相比，MMP2的表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，而10 μmol/L瑞舒伐他汀預(yù)處理可顯著降低MMP2的表達(dá)水平(P<0.05)，見圖6。

5 瑞舒伐他汀對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的BMECs中p-NF-κB、p-P38和p-JNK蛋白水平的影響

與對(duì)照組比較，缺氧/復(fù)氧均出現(xiàn)p-NF-κB上調(diào)，10 μmol/L瑞舒伐他汀干預(yù)可使p-NF-κB的蛋白水平顯著下降(P<0.05)。除此以外，P38和JNK信號(hào)通路也參與調(diào)節(jié)MMP2和MMP9的表達(dá)，與正常組相比，OGD 3 h/R 24 h組和OGD 6 h/R 24 h組p-P38和p-JNK的蛋白水平均上升；而與缺氧/復(fù)氧組相比，使用瑞舒伐他汀預(yù)處理后，p-P38和p-JNK的蛋白水平降低(P<0.05)，見圖7。說明瑞舒伐他汀能夠降低P38 MAPK、JNK和NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白P38、JNK、NF-κB蛋白磷酸化的水平，從而抑制缺氧/復(fù)氧下BMECs的MMP9和MMP2表達(dá)水平。

討 論

腦梗死是危害中老年人身體健康的主要?dú)⑹諿8]。目前針對(duì)腦梗死最有效的治療手段是時(shí)間窗(腦梗死發(fā)生3 h或6 h)內(nèi)進(jìn)行血管再通治療[9-10]，但是血流再灌注的同時(shí)，常伴隨一種棘手的副反應(yīng)為再灌注損傷[11]。再灌注損傷能夠引起B(yǎng)BB損害，腦水腫甚至神經(jīng)元丟失等[12]。這也是目前臨床上影響腦梗死患者治療效果的關(guān)鍵因素。如果能在再灌注損傷發(fā)生前使用藥物維護(hù)BBB的結(jié)構(gòu)及功能，無疑能增加血管再通治療的安全性，從而促進(jìn)有效治療方案的實(shí)施。大量已證實(shí)研究他汀類藥物在降低血低密度脂蛋白外，還有一系列非調(diào)脂性腦缺血保護(hù)效應(yīng)，如抗炎和保護(hù)海馬神經(jīng)元損傷等作用，臨床上被廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管疾病的預(yù)防及治療[13-14]。但臨床目前使用的瑞舒伐他汀在缺血再灌注情況下對(duì)BBB主要結(jié)構(gòu)成分內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制尚不明確。

Figure 3.Analysis of BMEC proliferation via CFDA-SE staining. A： control group; B: BMECs were cultured for 24 h; C: OGD 3 h group; D: OGD 3 h/R 24 h group; E: pretreatment with rosuvastatin (Ros) in OGD 3 h group; F: pretreatment with rosuvastatin in OGD 3 h/R 24 h (OGD 3 h/R 24 h+Ros) group; G: OGD 6 h group; H: OGD 6 h/R 24 h group; I: pretreatment with rosuvastatin in OGD 6 h group; J: pretreatment with rosuvastatin in OGD 6 h/R 24 h (OGD 6 h/R24 h+Ros). The results were presented as ratio from CFSE positive cells compared with OGD-treated cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD 3 h/R 24 h group;△P<0.05vsOGD 6 h/R 24 h group.

圖3CFDA-SE染色檢測(cè)BMECs增殖

執(zhí)行BBB結(jié)構(gòu)功能的最主要成分是BMECs，本研究通過缺氧/復(fù)氧處理BMECs模擬體內(nèi)BBB內(nèi)皮缺血再灌注損傷損傷，從而探討瑞舒伐他汀對(duì)BBB內(nèi)皮缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 μmol/L瑞舒伐他汀能提高不同損傷程度缺血/復(fù)氧損傷所抑制的BMECs存活率及增殖活性[7]。近年研究證實(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶受缺氧及復(fù)氧刺激后，MMPs活性明顯上調(diào)，參與BBB緊密連接的降解的病理生理過程，是影響B(tài)BB通透性和細(xì)胞存活的重要機(jī)制之一[15-16]，主要的是缺血再灌注損傷可誘發(fā)MMP2及MMP9的高表達(dá)，通過降解腦血管基底膜的主要成分及BBB內(nèi)緊密連接，造成BBB細(xì)胞皺縮死亡，引起血液成分外滲，繼而出現(xiàn)再灌注后血管源性腦水腫[17];另外，缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子α、表皮生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄、酶原活化和蛋白水解酶活方面影響MMP2和MMP9的生物活性[18-19]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺氧/復(fù)氧損傷后MMP2及MMP9的表達(dá)明顯上升，10 μmol/L瑞舒伐他汀可通過降低MMP2及MMP9表達(dá)維持BMEC的完整性，同時(shí)也降低由于MMP2及MMP9引起的細(xì)胞凋亡。有報(bào)道提示，內(nèi)皮凋亡的發(fā)生與線粒體功能障礙相關(guān)，缺血再灌注損傷后線粒體腫脹，并導(dǎo)致線粒體膜破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果表明，缺氧/復(fù)氧損傷發(fā)生后，線粒體抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl2與凋亡相關(guān)蛋白Bax的比例下調(diào)，證實(shí)線粒體功能下降，同時(shí)caspase3活化增加，而瑞舒伐他汀可上調(diào)Bcl2/Bax比值并降低cleaved caspase-3的蛋白水平，從而說明瑞舒伐他汀克改善線粒體功能，減輕缺血再灌注損傷引起的凋亡增加的現(xiàn)象。

Figure 4.The protein levels of cleaved caspase-3 in BMECs detected by immunofluorescence staining (scale bar=100 μm). Cleaved caspase-3 was examined using fluorescently labeled antibodies against cleaved-caspase 3 (red) . Nuclei were stained with DAPI (blue). The results were presented as ratio from cleaved-caspase3 positive cells compared with DAPI positive cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD 3 h/R 24 h group;△P<0.05vsOGD 6 h/R 24 h group.

圖4免疫熒光染色檢測(cè)瑞舒伐他汀對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的BMECs凋亡相關(guān)蛋白cleavedcaspase-3的水平

既往文獻(xiàn)亦報(bào)道證實(shí)絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)在缺血再灌注損傷后可激活P38和JNK磷酸化，參與內(nèi)皮損傷的病理生理過程并參與細(xì)胞凋亡發(fā)生，MAPK激活可促進(jìn)MMP9的活化和炎癥因子表達(dá)[21]。另外，MMP9基因啟動(dòng)子序列670～599段可受NF-κB p65結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別，引起核內(nèi)移，伴隨后者磷酸化增加，誘導(dǎo)MMP9基因轉(zhuǎn)錄起始，炎癥因子在NF-κB磷酸化反應(yīng)后釋放增加，從而進(jìn)一步募集外周血的中性粒細(xì)胞聚集BBB的內(nèi)皮表面，造成MMP9和MMP2的大量釋放，加深對(duì)BBB的損害，進(jìn)一步導(dǎo)致管腔破壞，腦水腫發(fā)生，神經(jīng)元壞死等[22]。本研究的結(jié)果表明，缺氧/復(fù)氧損傷發(fā)生后，瑞舒伐他汀可抑制P38、JNK以及NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白激活。

Figure 5.Western blot analysis was used to determine the expression of Bcl-2/Bax. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD 3 h/R 24 h group;△P<0.05vsOGD 6 h/R 24 h group.

圖5Westernblot檢測(cè)Bcl-2/Bax表達(dá)水平

本研究仍有一定的局限，BBB的通透性常與緊密連接蛋白及鈣黏連蛋白相關(guān)，本研究針對(duì)瑞舒伐他汀對(duì)BBB的緊密連接是否有保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究揭示瑞舒伐他汀可抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的BMECs再灌注損傷中相關(guān)p38、JNK以及NF-κB信號(hào)通路的激活，從而減少M(fèi)MP2及MMP9活化，使之與MMP2和MMP9相關(guān)的細(xì)胞凋亡減少。這將為瑞舒伐他汀在BBB通透性和出血轉(zhuǎn)化損傷中的改善作用提供機(jī)制說明，為更好的應(yīng)用該藥物提供理論支持。

Figure 6.The protein levels of MMP2 and MMP9 were determined by Western blot. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD 3 h/R 24 h group;△P<0.05vsOGD 6 h/R 24 h group.

圖6Westernblot檢測(cè)MMP2和MMP9的蛋白水平

Figure 7.Western blot analysis was used to determine the protein levels of p-NF-κB, p-P38 and p-JNK. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD 3 h/R 24 h group;△P<0.05vsOGD 6 h/R 24 h group.

圖7Westernblot檢測(cè)pNF-κB、p-P38及p-JNK的蛋白水平