融合蛋白TAP-SSL5抑制動(dòng)靜脈血栓形成*

曲小龍， 馮世斌， 彭 松， 陳 強(qiáng)， 胡厚源

[陸軍軍醫(yī)大學(xué)(原第三軍醫(yī)大學(xué))西南醫(yī)院心血管內(nèi)科， 重慶 400038]

發(fā)生在動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊基礎(chǔ)上的急性血栓形成，是急性心肌梗死、心臟性猝死和腦卒中等心腦血管急癥的主要原因。在血栓形成的過(guò)程中，血小板激活、粒細(xì)胞聚集、局部炎癥反應(yīng)以及凝血系統(tǒng)的激活相互影響、相互促進(jìn)[1]。過(guò)去的幾十年中，抗血小板藥物的應(yīng)用，特別是血小板二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)受體抑制劑的廣泛應(yīng)用，在動(dòng)脈血栓性疾病的二級(jí)預(yù)防中發(fā)揮了極為重要的作用。然而，對(duì)于血栓形成過(guò)程中炎癥反應(yīng)以及凝血系統(tǒng)的激活卻沒(méi)有得到相應(yīng)的重視[2]。

金黃色葡萄球菌超抗原樣蛋白-5(staphylococcal superantigen-like protein 5，SSL5)是金黃色葡萄球菌分泌的一種蛋白，可與粒細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)結(jié)合，從而抑制粒細(xì)胞與血小板的結(jié)合及粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的滾動(dòng)[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SSL5 可與血小板表面的糖蛋白(glycoprotein，GP)Ibα和糖蛋白VI(GPVI )結(jié)合[5]，提示SSL5可能通過(guò)抑制 GPIb-IX-V與血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)、GPVI和膠原的相互作用，從而減少血小板在血管壁的黏附。所以我們將SSL5 作為功能兼引導(dǎo)分子，與活化的凝血因子X(jué)(activated coagulation factor X，F(xiàn)Xa) 的直接抑制劑蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide，TAP)融合，構(gòu)建具有抗炎和抗凝雙重活性的新型融合蛋白TAP-SSL5[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TAP-SSL5保留了SSL5與血小板表面的GPIbα結(jié)合的能力[7]，提示其可能抑制血小板在損傷血管表面黏附，從而抑制動(dòng)脈血栓的形成；同時(shí)，TAP-SSL5不僅抑制激活的血小板與粒細(xì)胞[8]和淋巴細(xì)胞[9]的結(jié)合，還可抑制血小板微粒與單核細(xì)胞的結(jié)合及單核細(xì)胞表面巨噬細(xì)胞抗原-1(macrophage antigen-1，Mac-1)的活化[10]，表明其具有明顯的抗炎效應(yīng)。藥理學(xué)分析顯示，TAP-SSL5對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)無(wú)明顯影響，具有較好的安全性，無(wú)明顯的毒副作用[11]，并已有學(xué)者對(duì)TAP-SSL5藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了相關(guān)研究[12]。

本課題利用表達(dá)純化的融合蛋白TAP-SSL5，以流式細(xì)胞術(shù)在體外檢測(cè)TAP-SSL5與粒細(xì)胞表面PSGL-1的結(jié)合能力以及其對(duì)FXa活性的抑制作用；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，首先采用SD大鼠建立下腔靜脈血栓形成模型，探討TAP-SSL5對(duì)靜脈血栓形成的影響，并采用 C57BL/6J小鼠建立腸系膜動(dòng)脈血栓形成模型，應(yīng)用雙光子顯微鏡連續(xù)觀測(cè)TAP-SSL5對(duì) FeCl3誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成的影響，旨在評(píng)價(jià) TAP-SSL5 在抑制動(dòng)靜脈血栓形成方面的作用，探討通過(guò)相應(yīng)引導(dǎo)分子將抗凝物質(zhì)靶向到病變局部，從而有效地抑制血栓形成的新思路。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠(雄性，12周齡，體質(zhì)量250～300 g)和SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(雄性，體質(zhì)量20～25 g)均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)(原第三軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SYXK(軍)2012-0030。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 PE標(biāo)記的小鼠抗人CD162(PSGL-1)單克隆抗體(PE-KPL-1)和PE標(biāo)記的小鼠IgG1(mIgG1-PE)購(gòu)自BD；Penta-His Alexa Fluor 488和FITC-mouse IGg 1購(gòu)自QIAGEN；Calcein-AM購(gòu)自Sigma；P-selectin購(gòu)自R&D；FACTOR Xa購(gòu)自HBM；利伐沙班(rivaroxaban)購(gòu)自Bayer；Russell’s viper venom-factor X activator(RVV-X)購(gòu)自Abcam。

2 方法

2.1蛋白的表達(dá)與純化 重組蛋白TAP-SSL5及SSL5的表達(dá)與純化按照本課題組之前的方法獲得[6], TAP-SSL5化學(xué)純度為98%，相對(duì)分子質(zhì)量為3.2×104kD，重組SSL5蛋白純度>90%，相對(duì)分子質(zhì)量為2.7×104kD。

2.2雙偏振干涉(dual-polarization interferometry，DPI)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白的吸附 DPI實(shí)驗(yàn)在硅羥基芯片上展開，所用溶液均為超純水配制。選擇PBS為緩沖液，預(yù)先用氬氣脫氣15～20 min；再分別以80%乙醇溶液和雙蒸水進(jìn)行基線校正;用三甲基硅烷將2個(gè)通道修飾成疏水表面，500 mg/L TAP-SSL5結(jié)合到2個(gè)通道表面, I通道作為對(duì)照組，Ⅱ通道表面吸附sialyl Lewis X(sLeX),雙通道以5 μL/min 速度灌滿sLeX溶液。用DPI數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算芯片表面蛋白的吸附親和力。

2.3人外周血粒細(xì)胞及血小板的分離和純化 人外周血來(lái)源為健康志愿者，并經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，采血前2周內(nèi)未服用任何藥物。人粒細(xì)胞的分離采用梯度離心法，具體方法按照本課題組之前的方法實(shí)施[8]。

2.4TAP-SSL5競(jìng)爭(zhēng)性抑制KPL-1與粒細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn) 吸取細(xì)胞懸液， 1 000 r/min離心5 min；IMDM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L；分別吸取100 μL細(xì)胞懸液移入流式細(xì)胞管；蛋白組管分別加入0、1、3和10 μL TAP-SSL5溶液(濃度為1 g/L)，室溫孵育20 min；PBS洗滌細(xì)胞2次；同型對(duì)照管加入5 μL mIgG1-PE，蛋白組管加入5 μL PE-KPL-1，室溫孵育20 min；PBS洗滌細(xì)胞2次；調(diào)整細(xì)胞懸液體積為200 μL，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果。

2.5TAP-SSL5抑制粒細(xì)胞及HL60細(xì)胞在P-selectin表面的黏附實(shí)驗(yàn)[13]取黑色底部透明的96孔酶標(biāo)板，每孔加入3 mg/L P-selectin溶液100 μL， 4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗滌并吸取細(xì)胞懸液后離心，加入1/10體積Calcein-AM，Hanks液洗滌后分別以0～30 mg/L濃度TAP-SSL5及10 mg/L KPL-1孵育細(xì)胞，PBS再次洗滌后熒光倒置顯微鏡觀察；熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2.6TAP-SSL5對(duì)FXa活性的抑制作用

2.6.1TAP-SSL5對(duì)純化的FXa活性的抑制作用[14]實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段各反應(yīng)物濃度分別為TAP-SSL5：0、0.3、1.0、3.0和10.0 mg/L； TAP 3 mg/L；rivaroxaban：1 mg/L。室溫下反應(yīng)10 min，每孔加入20 μL S2765溶液，室溫下避光反應(yīng)15 min；每孔加入0.1 mol/L的H2SO4溶液50 μL終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm處吸光度(A)值。

2.6.2TAP-SSL5對(duì)血漿中FXa活性的抑制作用[15]分別采集健康成年志愿者及12周齡雄性C57BL/6J小鼠全血，以1/10體積加入3.8% 枸櫞酸鈉溶液抗凝，采血前2周內(nèi)未應(yīng)用任何抗凝血藥物。離心后吸取上清，用PBS按1 ∶5稀釋，各組分別取10 μL用于實(shí)驗(yàn)。各組TAP-SSL5濃度為0、 0.3、 1.0、 3.0和10.0 mg/L，不同濃度的TAP-SSL5 與RVV-X稀釋液總體積為20 μL。血漿與該混合液共同孵育15 min(37 ℃)；加入底物S2765溶液孵育20 min；最后以0.1 mol/L H2SO4溶液50 μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)405 nm處吸光度(A)值。

2.7TAP-SSL5抑制FeCl3誘導(dǎo)小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成

2.7.1實(shí)驗(yàn)分組 雄性 C57BL/6J小鼠10只，隨機(jī)分為2組，每組5只，分別為PBS組和對(duì)照TAP-SSL5組。

2.7.2小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓誘導(dǎo)模型的建立及活體成像觀察 雄性 C57BL/6J 小鼠，0.3%戊巴比妥鈉將其麻醉，固定后于眼球后注射 0.02%羅丹明 6G 100 μL標(biāo)記血小板和粒細(xì)胞，腹部脫毛后，用75%乙醇消毒，腹部中 1/3 正中切口，從切口處牽出一段腸管及其系膜鋪于板上，在雙光子顯微鏡下選擇周圍脂肪較少、直徑為(100±10) μm的腸系膜動(dòng)脈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，錄制基線影像3 min，將濾紙片(1 mm×4 mm)浸潤(rùn) 10% FeCl3溶液，貼于腸系膜動(dòng)脈上，5 min 后取下濾紙片，連續(xù)觀測(cè)損傷動(dòng)脈處血栓形成情況，并實(shí)時(shí)記錄該部位的影像，總時(shí)間 40 min或至管腔閉塞。

2.7.3TAP-SSL5抑制FeCl3誘導(dǎo)小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成 將重組蛋白稀釋到相應(yīng)濃度后，按10 mg/kg體質(zhì)量從小鼠尾靜脈注射；30 min 后行腹部切開，選擇腸系膜動(dòng)脈進(jìn)行損傷?；铙w成像動(dòng)態(tài)觀測(cè)小鼠腸系膜動(dòng)脈的損傷和小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成。

2.7.4小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成的影像分析 采用 ZEN 2012 圖像分析軟件對(duì)雙光子顯微鏡錄制的血管影像進(jìn)行如下分析：(1)實(shí)驗(yàn)段腸系膜動(dòng)脈直徑的測(cè)量：直徑在(100±10) μm 范圍內(nèi)的血管方可進(jìn)行后續(xù)分析；(2)血栓初發(fā)時(shí)間：即動(dòng)脈損傷后至血栓直徑達(dá)到 10 μm 的時(shí)間；(3)管腔閉塞時(shí)間(occlusion time，OT): 以血流停止>10 s 界定管腔閉塞，以血管損傷至管腔閉塞的時(shí)間反映血栓形成的時(shí)間，OT 越長(zhǎng)說(shuō)明藥物的抗血栓作用越強(qiáng)。

2.8TAP-SSL5對(duì)FeCl3誘導(dǎo)SD大鼠下腔靜脈血栓形成的影響

2.8.1實(shí)驗(yàn)分組 40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為PBS組、TAP-SSL5(3 mg/kg)組、TAP(1 mg/kg)組、SSL5(2 mg/kg)組及SSL5-T175P(2 mg/kg)組，每組8只。另取40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為PBS組、小劑量(0.3 mg/kg) TAP-SSL5組、中劑量(1 mg/kg) TAP-SSL5組和大劑量(3 mg/kg) TAP-SSL5組，每組10只。

2.8.2FeCl3誘導(dǎo)的SD大鼠腔靜脈血栓模型的建立 取雄性SD大鼠，戊巴比妥鈉溶液麻醉；尾靜脈注射給藥后，行腹正中線切口，暴露下腔靜脈；給藥15 min后，于左腎靜脈下方以4號(hào)線將下腔靜脈與一支20G鈍頭針環(huán)扎，以3.5 μL 10% FeCl3溶液浸濕3 mm見(jiàn)方的濾紙片，將其置于結(jié)扎線下方；5 min后去掉濾紙片，繼續(xù)觀察30 min后，縱行剖開結(jié)扎線以下的下腔靜脈，取出血栓精確稱取濕重；心臟采集抗凝血，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TAP-SSL5 與sLeX的結(jié)合

按本實(shí)驗(yàn)TAP-SSL5提取及純化方案，重組TAP-SSL5的純度達(dá)到95%以上。TAP-SSL5的三維結(jié)構(gòu)模型見(jiàn)圖1A。多糖sLeX是PSGL-1結(jié)構(gòu)中與P-selectin和E-selectin結(jié)合的位點(diǎn)，調(diào)控血小板與內(nèi)皮細(xì)胞和粒細(xì)胞之間的結(jié)合。SSL-5正是可以通過(guò)與P-selectin或E-selectin競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PSGL-1，發(fā)揮抑制炎癥的作用。我們用DPI技術(shù)分析TAP-SSL5是否保留了SSL5與sLeX結(jié)合的能力，結(jié)果表明TAP-SSL5呈劑量依賴性地結(jié)合sLeX，親和常數(shù)為(3.54± 0.41) μmol/L,見(jiàn)圖1B。

Figure 1.Molecular structure of the recombinant fusion protein TAP-SSL5 and its binding capability to sialyl Lewis X (sLeX). A: the ribbon diagram showed the fold of SSL5 and the connection of TAP with N-terminal open. The bound sLeXwas shown in stick mode; B: TAP-SSL5 binding to sLeXwas measured by dual-polarization interferometry analysis. The affinity constant was determined from the nonlinear curve fitting.

圖1TAP-SSL5的三維結(jié)構(gòu)及其與sialylLewisX的親和力檢測(cè)

2 TAP-SSL5 可與粒細(xì)胞表面PSGL-1結(jié)合并抑制粒細(xì)胞與 P-selectin 和血小板的結(jié)合

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，TAP-SSL5 可與粒細(xì)胞結(jié)合，其結(jié)合率隨著 TAP-SSL5 蛋白濃度的增加而升高，見(jiàn)圖2A；同時(shí)，TAP-SSL5競(jìng)爭(zhēng)性抑制 PE-KPL-1與粒細(xì)胞或HL60細(xì)胞的結(jié)合，見(jiàn)圖2B， TAP-SSL5可使 PE-KPL-1 與粒細(xì)胞的結(jié)合顯著下降，表明TAP-SSL5 可與細(xì)胞表面的 PSGL-1 結(jié)合。TAP-SSL5 抑制HL60和粒細(xì)胞在 P-selectin 表面黏附熒光倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，隨著蛋白濃度的增加，鏡下的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果分析顯示，TAP-SSL5 可顯著抑制粒細(xì)胞或 HL60 細(xì)胞在 P-選擇素包被表面的黏附，見(jiàn)圖2C；同時(shí)， TAP-SSL5可抑制粒細(xì)胞與血小板的結(jié)合，見(jiàn)圖2D。

3 TAP-SSL5抑制 FXa 活性

TAP是FXa的直接抑制劑。為了驗(yàn)證融合蛋白 TAP-SSL5 是否具有抑制FXa活性的效應(yīng)，我們分別采用 FXa 蛋白和 RVV-X 激活血漿中的FX來(lái)做FXa活性抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明 TAP-SSL5 在體外可顯著抑制FXa活性，并且這種抑制效應(yīng)在0～10 mg/L范圍內(nèi)呈明顯的濃度依賴關(guān)系。陽(yáng)性對(duì)照 TAP 和rivaroxaban 對(duì) FXa 的抑制效應(yīng)均十分明顯，TAP-SSL5 對(duì) FXa 活性的抑制效應(yīng)稍低于同等摩爾濃度下的 TAP (P<0.01),見(jiàn)圖3A；同時(shí)，TAP-SSL5對(duì)健康人及小鼠血漿中激活的FXa均有顯著抑制作用，見(jiàn)圖3B。

4 TAP-SSL5抑制FeCl3誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成

結(jié)果顯示，在PBS組，經(jīng)10% FeCl3溶液作用后，小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成較為迅速，血小板迅速聚集到損傷的血管壁處并導(dǎo)致管腔閉塞，管腔閉塞時(shí)間為(12.14±0.82) min；在TAP-SSL5組，OT為(38.73±2.21) min，較PBS組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，表明TAP-SSL5可明顯抑制小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓的形成的效應(yīng)，見(jiàn)圖4。

5 TAP-SSL5抑制FeCl3誘導(dǎo)的SD大鼠下腔靜脈血栓形成

在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用TAP(1 mg/kg)、TAP-SSL5(3 mg/kg)和SSL5(2 mg/kg)均可明顯抑制腔靜脈內(nèi)血栓的形成，而SSL5的無(wú)功能突變體SSL5-T175P(2 mg/kg)則無(wú)此作用，見(jiàn)圖5A。隨著TAP-SSL5濃度的增加，其抑制血栓形成的作用也愈加明顯，見(jiàn)圖5B，而尾部出血時(shí)間也明顯延長(zhǎng)(P<0.01),見(jiàn)圖5C，但PT無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖5D。

討 論

最近臨床研究表明，盡管給予了合適的治療，還是有10%左右的急性冠脈綜合征的患者發(fā)生心腦血管事件,該類事件發(fā)生的主要原因是動(dòng)脈粥樣硬化病變基礎(chǔ)上的急性血栓形成?？寡“搴涂鼓幬镫m然在一定程度上可以改善心腦血管病患者的預(yù)后，但其抗血栓效應(yīng)和出血風(fēng)險(xiǎn)之間的矛盾始終存在。因此，研制更加有效、更加安全的抗血栓藥物對(duì)心腦血管疾病的防治具有重要意義。

血小板首先黏附并聚集于受損的血管壁或者斑塊破裂的部位，是止血和血栓形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，血小板與粒細(xì)胞的聚集體在心絞痛、心肌梗死和PCI術(shù)后患者的循環(huán)血液中有明顯增加[17]。血小板表面的P-selectin 和粒細(xì)胞表面的PSGL-1的結(jié)合是血小板-粒細(xì)胞聚集體形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。 P-selectin與PSGL-1結(jié)合后，通過(guò)激活粒細(xì)胞Mac-1和促進(jìn)組織因子(tissue factor，TF) 的表達(dá)，合成和釋放多種炎癥因子，這些機(jī)制共同參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展和動(dòng)脈血栓的形成[19-20]；另一方面，粒細(xì)胞表面的TF對(duì)凝血系統(tǒng)的激活是血栓形成的重要原因[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在粒細(xì)胞缺乏的小鼠中，血栓形成明顯減少，提示了粒細(xì)胞在動(dòng)脈血栓形成過(guò)程中可能有著極為重要的作用[22]。 暴露的TF通過(guò)與凝血因子VII/VIIa形成TF-FVIIa復(fù)合體激活FX，后者使凝血酶原活化，激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，血小板可以促進(jìn)NETs的形成和TF的表達(dá)[24]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAP-SSL5可以通過(guò)與粒細(xì)胞表面PSGL-1的結(jié)合，抑制血小板與粒細(xì)胞的聚集，從而發(fā)揮抑制動(dòng)脈血栓形成的作用，一方面，TAP-SSL5可以抑制血小板與粒細(xì)胞之間的相互作用，從而減少TF的表達(dá)；另一方面，在SSL5的引導(dǎo)下，TAP可靶向聚積于粒細(xì)胞，主要在炎癥部位發(fā)揮抗凝作用，避免因廣泛抗凝而出現(xiàn)嚴(yán)重的出血并發(fā)癥。

Figure 2.TAP-SSL5 binded to PSGL-1 on human neutrophils and inhibited the formation of platelet-leukocyte aggregates. A: the representative images of flow cytometry histogram overlay of TAP-SSL5 (FITC labeled) binding to human neutrophils. Grey area indicated the negative control, and the peaks indicated the binding of TAP-SSL5 at 1, 3, and 10 mg/L, respectively; B: the binding of PE-KPL-1 (anti-CD162) was competitively inhibited by TAP-SSL5. Grey area indicated the isotype control, the thick grey line indicated the binding of PE-KPL-1 only, and the other peaks (from the second right to left) indicated the binding of PE-KPL-1 inhibited by TAP-SSL5 at 1, 3, and 10 mg/L, respectively; C: TAP-SSL5 inhibited the adhesion of neutrophils to P-selectin coated surface under static condition. Calcein AM-labeled human neutrophils were treated with TAP-SSL5 (1～30 mg/L) for 10 min, while 10 mg/L KPL-1 was used as positive control. The data represent relative adhesion of cells compared with untreated cells; D: the effects of 10 mg/L TAP-SSL5 on the formation of platelet-leukocyte aggregates. Mean±SEM.n=6.△P<0.05,△△P<0.01vs0 mg/L group;*P<0.05，**P<0.01vsbasline group.

圖2TAP-SSL5可與粒細(xì)胞結(jié)合并抑制血小板-中性粒細(xì)胞聚集體的形成

Figure 3.TAP-SSL5 inhibited the activity of activated coagulation factor X (FXa)invitro. A: TAP-SSL5 inhibited human FXa activity in a concentration-dependent manner. 3 mg/L TAP and 1 mg/L rivaroxaban were used as positive controls; B: TAP-SSL5 inhibited the formation of FXa in human and mouse plasma activated by RVV-X. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vs0 mg/L control;△P<0.05vsTAP group;#P<0.05,##P<0.01vs0.1 mg/L group.

圖3TAP-SSL5對(duì)FXa活性的抑制作用

Figure 4.TAP-SSL5 inhibited FeCl3-induced mesenteric arterial thrombosis. Mean±SEM.*P<0.05vsPBS group.

圖4TAP-SSL5對(duì)FeCl3誘導(dǎo)下小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成的抑制作用

Figure 5.A: TAP-SSL5 inhibited FeCl3-induced formation of thrombi in the inferior vena cava of Sprague-Dawley rats. (n=8); B: TAP-SSL5 inhibits 10% ferric chloride-induced formation of thrombi in a dose-dependent manner (n=10); C: TAP-SSL5 prolonged tail bleeding time in rats (n=10); D: TAP-SSL5 did not prolong prothrombin time in rats (n=10). Mean±SEM.**P<0.01vsPBS group.

圖5TAP-SSL5抑制FeCl3誘導(dǎo)的大鼠下腔靜脈血栓形成

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，SSL5 可與血小板表面的GPIbα和GPVI 結(jié)合[5]。血小板表面的糖蛋白 GPIb-IX-V 復(fù)合物與vWF的結(jié)合在血小板與血管壁的黏附中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其中GPIbα是vWF的主要配體，其與 vWF 的結(jié)合介導(dǎo)了快速流動(dòng)血液中的血小板在血管壁的黏附[21]。有研究顯示，GPIbα 抑制劑能夠抑制血栓形成，對(duì)出血時(shí)間的影響也較小[22]。因此TAP-SSL5可通過(guò)抑制 GPIb-V-IX 與 vWF、GPVI 與膠原的相互作用，而抑制血小板在損傷血管部位的黏附。

在血栓形成的過(guò)程中，血小板聚集和凝血系統(tǒng)的激活也是相互促進(jìn)的。例如，凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終產(chǎn)物凝血酶，不僅可以催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，還能夠通過(guò)PAR-1/PAR-4受體激活血小板，促進(jìn)血小板的聚集。由于FXa是外源性和內(nèi)源性凝血級(jí)聯(lián)的交匯點(diǎn)，可以直接活化凝血酶原，是理想的抗凝靶點(diǎn)。而TAP 是自然界中已知最強(qiáng)的 FXa 抑制劑，能夠直接抑制 FXa 活性。同時(shí)，為降低抗凝治療期間的出血風(fēng)險(xiǎn)，通過(guò)引導(dǎo)分子將抗凝物質(zhì)靶向到病變部位，可以在局部達(dá)到較高的濃度而有效地抑制血栓形成；同時(shí)，血液循環(huán)中抗凝劑的濃度較低，對(duì)凝血系統(tǒng)性的影響較小，從而降低出血風(fēng)險(xiǎn)。鑒于此，本課題組將 TAP 和 SSL5 通過(guò)基因重組技術(shù)進(jìn)行融合，構(gòu)建了融合蛋白 TAP-SSL5，其中SSL5 在與 GPIbα 和GPVI 結(jié)合而抑制血小板與血管壁的黏附，還作為引導(dǎo)分子將 TAP 靶向到血小板表面以及血管病變局部，從而可更有效地抑制血栓形成。TAP-SSL5完整地保留了SSL5和TAP的功能，能夠同血小板表面的GPIbα和 GPVI結(jié)合，并有效抑制 FXa 活性。

TAP可直接有效地抑制FXa的活性，而通過(guò)重組技術(shù)獲得的融合蛋白TAP-SSL5具有對(duì)FXa的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其對(duì)FXa活性的抑制作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TAP-SSL5可有效抑制FeCl3誘導(dǎo)的大鼠下腔靜脈血栓形成，同時(shí)延長(zhǎng)大鼠尾部出血時(shí)間，而且SSL5也可抑制血栓形成，這說(shuō)明TAP-SSL5抑制血栓的形成的作用不僅源于TAP，同時(shí)也與SSL5的作用有關(guān)。因此，除了具備有抗FXa活性的功能之外，TAP-SSL5還可通過(guò)與血小板GPIbα相結(jié)合，發(fā)揮抗血栓形成的作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TAP-SSL5在高濃度時(shí)也可激活血小板，而之前與之類似的研究表明，血小板GPIIb/IIIa拮抗劑RGD肽、依替巴肽和替羅非班等發(fā)揮抗血小板作用的同時(shí)也有激活血小板的作用[25]。鑒于重組融合蛋白TAP-SSL5主要針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂所導(dǎo)致的血栓形成，且目前針對(duì)靜脈血栓相關(guān)研究及藥物已很成熟，故未在TAP-SSL5抑制靜脈血栓形成方面做進(jìn)一步研究。

我們應(yīng)用雙光子顯微鏡，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的小鼠腸系膜動(dòng)脈血栓形成過(guò)程的檢測(cè)，其光毒性小、穿透力強(qiáng)、成像信噪比高，更適合于對(duì)活體組織的長(zhǎng)時(shí)間觀察。結(jié)果顯示 采用10% FeCl3短時(shí)間損傷小鼠腸系膜動(dòng)脈后，可迅速導(dǎo)致動(dòng)脈血栓形成；而提前經(jīng)小鼠尾靜脈注射給予TAP-SSL5，可以顯著抑制FeCl3誘導(dǎo)下小鼠腸系膜動(dòng)脈的血栓形成。

本研究進(jìn)一步證實(shí)了TAP-SSL5 對(duì)動(dòng)脈和靜脈血栓形成的預(yù)防作用，其具有的抗炎抗凝獨(dú)特機(jī)制和靶向性，為進(jìn)一步提高動(dòng)脈粥樣硬化性血栓事件防治的有效性和安全性提供了新的策略。