老化小膠質(zhì)細(xì)胞影響多巴胺能神經(jīng)元存活率的研究

曹丹 任艷 羅曉光 魏玲

帕金森病(parkinson disease, PD)是一種中老年常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性疾病, 小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia, MI)介導(dǎo)的神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)在PD發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［1］。MI是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的巨噬細(xì)胞及免疫細(xì)胞, 在腦部炎癥、腦缺血、阿爾茨海默病、PD等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮著修復(fù)和損傷的雙重作用。有研究證實MI老化后其功能由神經(jīng)保護(hù)向神經(jīng)損傷轉(zhuǎn)變。因此, 本實驗擬建立老化MI與受損的PC12神經(jīng)元共育的微環(huán)境模擬PD細(xì)胞模型來觀察老化MI對多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元生存的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 MI培養(yǎng) MI細(xì)胞為原代大鼠的神經(jīng)MI, 購于PriCells生物醫(yī)藥科技有限公司。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗, 以4×105/孔種植于篩板中 , 以終濃度 100 ng/ml 佛波酯 (PMA)刺激MI細(xì)胞72 h后換掉含有PMA的培養(yǎng)液, 并磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3遍作為共育時所需老化MI。

1.2 PC12傳代培養(yǎng) 復(fù)蘇后的PC12細(xì)胞(購于中國科學(xué)院細(xì)胞研究所)種于RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(購于Hyclone公司, 美國), 于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。PC12細(xì)胞呈半懸浮狀態(tài)生長, 傳代7～8次后轉(zhuǎn)為貼壁生長。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 損傷PC12制備 以低劑量250 nM魚藤酮(購于Sigma,美國)刺激PC12細(xì)胞8 h后, 收集損傷PC12細(xì)胞于24孔板上。

1.4 實驗分組 將過度活化后的MI及轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)移入生長有受損的PC12細(xì)胞內(nèi)的培養(yǎng)板內(nèi), 實驗分為三組：①空白對照組: 培養(yǎng)的PC12細(xì)胞, 未給予任何處理藥物；②PC12+老化MI組：PC12與老化MI共育；③魚藤酮PC12+老化MI組：魚藤酮損傷PC12后與老化MI共育。以孔板培養(yǎng)皿和相應(yīng)尺寸的轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)建立兩種細(xì)胞的共育系統(tǒng), 轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)孔徑8 μm,能夠允許轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)內(nèi)外的大分子蛋白和液體交流, 但不允許細(xì)胞通過。共育24 h結(jié)束后移走轉(zhuǎn)移篩板及其上面的細(xì)胞,對收集PC12細(xì)胞進(jìn)行PC12細(xì)胞凋亡檢測。

1.5 MI老化相關(guān)β-半乳糖苷酶(β-gal)染色 每孔加入300 μlβ-gal染色固定液 , 室溫固定 15 min；吸除細(xì)胞固定液 ,用PBS洗滌細(xì)胞3次；每孔加入300 μl染色工作液(試劑盒購于上海碧云天)；37℃無CO2溫箱孵育過夜；普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 PC12細(xì)胞凋亡檢測 按照凋亡試劑盒說明(購于上海碧云天), 以磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V-FITC)一碘化吡啶(PI)雙染進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡檢測。消化收集PC12細(xì)胞, 用冷PBS 充分洗滌細(xì)胞 2 次 , 250 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞 , 取195 μl的細(xì)胞懸液加入 5 μl Annexin V-FITC, 輕輕混勻后間隔3 min, 再加入 10 μl濃度為 20 ng/ml的 PI溶液 , 混勻后于室溫避光孵育 10 min, 加 300 μl結(jié)合緩沖液 , 輕輕混勻 , 流式細(xì)胞儀檢測, 每組均設(shè)3例樣本。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( -±s)表示, 采用 t檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老化MI形態(tài)鑒定 β-gal是一種鑒別細(xì)胞衰老的生物學(xué)標(biāo)志。在pH=6.0, 隨著細(xì)胞老化, 胞內(nèi)產(chǎn)生的藍(lán)色沉淀物也越多, 即染色陽性, 表明細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。但對靜止期細(xì)胞、永生化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的β-gal活性不顯色。β-gal染色結(jié)果顯示, PMA刺激MI組藍(lán)染陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加。

2.2 PC12細(xì)胞生長形態(tài)學(xué)變化 空白對照組為分化期PC12細(xì)胞, 胞體呈梭形或者三角形貼壁生長；PC12+老化MI組和魚藤酮PC12+老化MI組細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則, 突起結(jié)構(gòu)逐漸消失或者變短, 細(xì)胞體積逐漸變小, 變圓。

2.3 PC12細(xì)胞凋亡率測定 PC12+老化MI組和魚藤酮PC12+老化MI組的細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對照組, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 且魚藤酮PC12+老化MI組的細(xì)胞凋亡率最高。見表1。

表1 三組干預(yù)后PC12細(xì)胞凋亡率比較(±s,%)

表1 三組干預(yù)后PC12細(xì)胞凋亡率比較(±s,%)

注 ：與空白對照組比較 , aP＜0.05

組別 例數(shù) 細(xì)胞凋亡率空白對照組 3 17.51±1.11 PC12+老化MI組 3 41.37±0.69a魚藤酮PC12+老化MI組 3 42.54±0.83a

3 討論

PD是一種中老年常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變, 其主要病理標(biāo)志是路易小體形成和黑質(zhì)區(qū)DA能神經(jīng)元的死亡。其發(fā)病率隨年齡增長而顯著增加, 65歲以上人群發(fā)病率達(dá)1.7%, 80歲以上可達(dá)10%, 85歲以上的老人接近50%有輕度帕金森樣癥狀［2］。MI是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最有代表性的免疫細(xì)胞, 發(fā)揮監(jiān)測腦內(nèi)異常變化的功能。MI對外界環(huán)境刺激非常敏感, 既可以通過吞噬組織中的病原體及有害顆粒對神經(jīng)元起到保護(hù)作用, 也可以通過分泌炎性細(xì)胞因子對神經(jīng)元起毒性作用。有研究證實MI老化后其功能由神經(jīng)保護(hù)向神經(jīng)損傷轉(zhuǎn)變。近年來, 眾多研究報道MI激活參與中樞黑質(zhì)紋狀體炎癥過程, 從而加重PD的DA能神經(jīng)元的變性凋亡過程［3］。動物實驗證實：低劑量魚藤酮對青年鼠的DA神經(jīng)元沒有影響, 而在老年鼠則有 20%～30%的DA神經(jīng)元死亡［4］,可見老化提高了DA神經(jīng)元對神經(jīng)毒素的敏感性。本研究推測老化MI可分泌各種炎性介質(zhì), 持續(xù)對周圍微環(huán)境施加影響。當(dāng)腦內(nèi)老化MI大量存在時, 腦內(nèi)微環(huán)境發(fā)生改變, 遭遇病理刺激后發(fā)生過度炎癥反應(yīng), 引發(fā)氧化應(yīng)激產(chǎn)物的大量釋放, 促進(jìn)了DA神經(jīng)元的死亡。

老化MI不僅釋放的炎癥介質(zhì)顯著增多, 其對損傷的反應(yīng)也發(fā)生顯著改變。這些老化MI并不會迅速死亡而是長期存在于腦內(nèi), 通過釋放炎性介質(zhì)等持續(xù)對DA神經(jīng)元生存的微環(huán)境施加負(fù)面影響, 最終導(dǎo)致DA神經(jīng)元的大量死亡。PC12細(xì)胞因其在形態(tài)、生理、生化等功能特別是合成和儲存DA和去甲腎上腺素遞質(zhì)上與中腦DA 能神經(jīng)元功能十分接近而已成為體外替代DA 能神經(jīng)元常見的細(xì)胞模型。本實驗中老化MI與損傷的PC12共培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)MI和DA能神經(jīng)元的相互作用, 共培養(yǎng)后, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)老化的MI顯著降低了正常PC12和受損PC12的存活率。提示在本實驗環(huán)境下,老化的MI不利于損傷神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù), 具有神經(jīng)毒性作用。大量實驗發(fā)現(xiàn)過度激活的MI可以通過釋放大量毒性興奮性氨基酸等介導(dǎo)神經(jīng)元損傷。

綜上所述, 本研究體外模擬MI與黑質(zhì)DA能神經(jīng)元間相互作用, 結(jié)果證實老化的MI明顯提高了DA能神經(jīng)元的生存率, 其可能是通過持續(xù)的MI炎癥反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用導(dǎo)致神經(jīng)病理改變。