草魚魚種細(xì)菌性敗血癥病原的分離與鑒定

■ 陳昌福 曹麗敏 陳輝 方蘋

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；2 沈陽元豐飼料有限公司，沈陽 110202；3 江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心，南京 210029 ）

今年5月初，遼寧省沈陽市遼中區(qū)的養(yǎng)殖草魚（Ctenopharyngodon idellus）出現(xiàn)大范圍疾病流行，而且死亡率比較高?；疾〔蒴~出現(xiàn)比較典型的細(xì)菌性敗血癥的癥狀，主要特征是身體發(fā)黑、部分鱗片松動(dòng)、脫落，鰭條基部有出血現(xiàn)象，部分病魚的肛門紅腫，鰓上有大量黏液并且附有污泥。解剖病魚檢查，可見腹腔內(nèi)有腹水，腸道內(nèi)少有食物，腸道發(fā)紅、腸道內(nèi)有充氣的現(xiàn)象。

對(duì)具有上述癥狀的病魚，利用微生物學(xué)操作技術(shù)，從和患病魚體的腎臟和肝胰臟中進(jìn)行了致病菌的分離和鑒定?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 患病魚的來源與規(guī)格

用于分離致病菌的患病魚，主要取自遼寧省沈陽市遼中區(qū)劉二堡鎮(zhèn)及其周邊水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)成魚養(yǎng)殖池塘?；疾〔蒴~規(guī)格大多為100.0～200.0g的二齡草魚魚種，也有部分體重約為1,000.0g的大規(guī)格草魚。

1.2 致病菌株分離與純化

從養(yǎng)殖池塘中撈取魚體發(fā)黑、離群獨(dú)游于池塘邊上的患病草魚，將活體帶回實(shí)驗(yàn)室。在無菌條件下解剖魚體后，從其腎臟和肝胰臟中取樣，接種在盛有BHIA（Diffco）培養(yǎng)皿中。將接種好的培養(yǎng)皿，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，從培養(yǎng)皿中挑取單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接于BHIA培養(yǎng)皿中，進(jìn)行純化培養(yǎng)48h。

1.3 接種活菌與菌株再分離

從分離純化的多個(gè)菌株中，隨機(jī)取14個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株接種在BHIA（Diffco）培養(yǎng)皿中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中純培養(yǎng)48h后，用滅菌生理鹽水洗下培養(yǎng)皿中的菌落，將其菌體濃度調(diào)節(jié)成107cells/mL活菌液。對(duì)平均體重約100.0g的正常小草魚，經(jīng)胸鰭基部對(duì)每尾注射0.2mL菌液后，將其放回水族箱中繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。待供試魚出現(xiàn)與自然條件下相似的細(xì)菌性敗血癥癥狀后，撈取具有典型疾病癥狀的患病魚體，在無菌條件下從其腎臟和肝胰臟中再次分離菌株。將這些再分離菌株與初分離并用于接種供試魚的菌株，通過分子生物學(xué)和理化特性鑒定的方法，鑒定其菌株的種屬。

表1 分離菌株人工感染草魚后的發(fā)病、死亡時(shí)間與死亡率

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 根據(jù)菌株的16S rDNA鑒定

將初次分離的14個(gè)菌株和再分離的10個(gè)菌株純化培養(yǎng)后，寄送給生工生物工程（上海）股份有限公司，委托其檢測(cè)菌株的16S rDNA。

1.5 根據(jù)菌株的理化特性鑒定

按照《細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的鑒定參數(shù)，分別對(duì)初次分離的14個(gè)菌株和再分離的10個(gè)菌株，進(jìn)行了理化特性鑒定[1,2]。

2 結(jié)果

2.1 接種活菌后供試魚發(fā)病情況

對(duì)平均體重約為100.0g的正常小草魚經(jīng)胸鰭基部注射0.15～0.2mL活菌液后，供試魚發(fā)病情況如表1中所示。由表1所示結(jié)果可以看出，經(jīng)過接種不同菌株活菌液后，供試魚出現(xiàn)細(xì)菌性敗血癥的情況和死亡數(shù)量是有所不同的，顯示出了菌株的毒力存在差異。

2.2 菌株的種屬

將初次分離和再次從患病魚體中分離的部分致病菌株，進(jìn)行分子生物學(xué)和理化特性鑒定結(jié)果如表2所示。由表2所示結(jié)果可以看出，檢測(cè)菌株的16S rDNA的分子生物學(xué)和理化特性鑒定結(jié)果是完全一致的。初次分離的14個(gè)菌株中有12個(gè)菌株是屬于A.hydrophila，只有2株是屬于A.sobria。而從人工致病的魚體中再次分離到的10個(gè)菌株，則均屬于A.hydrophila。

表2 從患病草魚體內(nèi)初分離和再次分離菌株的鑒定

3 討論

淡水魚類細(xì)菌性敗血癥主要是由氣單胞菌屬（Aeromonas）的幾種細(xì)菌引起。本研究的結(jié)果證實(shí)，從遼寧省遼中養(yǎng)殖區(qū)域患細(xì)菌性敗血癥草魚體內(nèi)分離的大部分能菌株，均屬于A.hydrophila，只有少數(shù)的屬于A. sobria。

淡水魚類細(xì)菌性敗血癥具有發(fā)病急、死亡率高的特點(diǎn)，一旦疾病暴發(fā)性地流行起來，要有效地控制疾病損失就比較困難了。迄今為止，對(duì)于養(yǎng)殖魚類細(xì)菌病的防控主要有兩條途徑，即免疫防控與藥物防控。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雖然已經(jīng)批準(zhǔn)了一種嗜水氣單胞菌的滅活疫苗[3]。但是，因?yàn)楦鞣N原因這種疫苗至今為止應(yīng)用范圍尚不廣泛。

我國(guó)雖然有幾種允許用于細(xì)菌性疾病治療的抗菌素類漁藥。但是，由于長(zhǎng)期以來沒有對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病菌藥物敏感性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，導(dǎo)致在采用藥物治療水生動(dòng)物疾病時(shí)，難以做到科學(xué)、精準(zhǔn)使用這些藥物，藥物治療水生動(dòng)物疾病的效果也就很難期待[4]。

本研究正是有鑒于上述問題存在，通過對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定，為藥物治療魚類這種細(xì)菌性疾病篩選合適藥物和確定用藥劑量。此外，還將通過研究這些菌株免疫原性和抗原性差異，從中篩選制備“自家疫苗”的菌株，研制能用于遼寧省遼中養(yǎng)殖區(qū)域的“自家疫苗”，進(jìn)行對(duì)該養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)養(yǎng)殖草魚細(xì)菌性敗血癥的免疫防控[5]。

（參考文獻(xiàn)略）