鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病研究初探

何賢臣 劉丹陽(yáng) 尹海富

1 鱖魚傳染性脾腎壞死病毒病

鱖魚是我國(guó)重要名特優(yōu)魚類之一，隨著人們對(duì)名貴水產(chǎn)品需求不斷增加，鱖魚養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，產(chǎn)值逐年上升。1994年在廣東省暴發(fā)并逐漸傳播開來鱖魚病毒病，成為限制鱖魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的制約因素，至今仍深度影響鱖魚產(chǎn)業(yè)。1997年吳淑勤等通過電鏡發(fā)現(xiàn)了病鱖脾臟中的病毒顆粒，病毒直徑約150nm，并證明該病毒能引起鱖魚大規(guī)模死亡。1998年何建國(guó)等通過回歸感染進(jìn)一步證明了該病毒的病原性，并通過組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鱖魚脾臟和腎臟是其感染的主要器官，且該病毒可導(dǎo)致鱖魚脾臟和腎臟壞死，因而命名為傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）。

2 ISKNV的形態(tài)結(jié)構(gòu)

1998年何建國(guó)等人根據(jù)該病毒為具囊膜20面體，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)寄生，直徑大小為150nm等特點(diǎn)，認(rèn)為ISKNV屬虹彩病毒科。核心含有一條線狀雙鏈DNA，基因組由111362個(gè)堿基組成，而且胞嘧啶（G）5端特征是高度甲基化，鳥嘌呤（C）和胞嘧啶（G）含量占54.78%。包括125個(gè)預(yù)測(cè)開放讀碼框ORF，與其他種類的虹彩病毒有高度同源性的ORF有35個(gè)，這些ORF主要與蛋白功能有關(guān)。

3 ISKNV的檢測(cè)方法

病毒病的診斷有病原分離、血清學(xué)、免疫學(xué)和分子技術(shù)四個(gè)不同的階段。常規(guī)的病毒分離，是指對(duì)動(dòng)物進(jìn)行攻毒感染實(shí)驗(yàn)、及利用敏感細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)和電鏡觀察，是一種對(duì)病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化和對(duì)其致病能力進(jìn)行研究的手段。常規(guī)血清學(xué)方法特異性雖高，但存在不敏感的缺點(diǎn)。近年來，隨著免疫印跡酶連免疫吸附、免疫熒光和膠體金等免疫方法的出現(xiàn)和發(fā)展，病毒的免疫學(xué)診斷已兼具特異性和靈敏性。若以ISKNV流行病學(xué)調(diào)查或者抗原、抗體的檢測(cè)作為目標(biāo)，可采用免疫學(xué)診斷為主要方法，分子生物學(xué)檢測(cè)為輔。若以檢測(cè)ISKNV存在及其種類、病毒含量、隱性感染等為目的，則主要采用分子生物學(xué)方法。為使結(jié)果準(zhǔn)確，必須結(jié)合多種檢測(cè)方法。

4 ISKNV的流行病學(xué)

由ISKNV分子流行病學(xué)結(jié)果可知，ISKNV宿主非常廣泛。海水魚類中已有6目、19科、52種魚類被檢出感染該病毒，平均感染率為14.6%，斜帶石斑、青斑、大黃魚、美國(guó)紅魚等種類都易流行ISKNV病害。淡水魚類中已有鱖魚、草魚、烏鱧、尼羅羅非魚、大口黑鱸等被檢出感染該病毒。養(yǎng)殖水體溫度在25℃～34℃時(shí)，感染ISKNV的鱖魚發(fā)病死亡率達(dá)90%以上，發(fā)病至死亡平均時(shí)間為17d，28℃～30℃則是健康養(yǎng)殖鱖魚發(fā)病的最危溫度，這與廣東省夏天氣溫高導(dǎo)致鱖魚ISKNV病發(fā)病率高的現(xiàn)象相吻合。在20℃時(shí)，健康養(yǎng)殖鱖魚則不發(fā)生ISKNV病害。

5 鱖魚ISKNV病的組織病理學(xué)

根據(jù)近年來在廣東省內(nèi)分離檢測(cè)到ISKNV感染的病料觀察得知，患病鱖魚典型癥狀：脾、腎腫大，呈紫黑色；肝呈白色，有出血點(diǎn)，花肝癥狀；鰓白色，貧血癥狀；腸內(nèi)充滿透明流晶樣液體。組織切片顯示，被ISKNV感染的鱖魚脾臟、頭腎細(xì)胞病變非常嚴(yán)重，可觀察到明顯的細(xì)胞腫大特征，且細(xì)胞核萎縮。電鏡下觀察顯示，脾臟、頭腎細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量病毒粒子。

6 ISKNV病的防治方法

鱖魚養(yǎng)殖戶慣用聚維酮碘、二氧化氯等化學(xué)藥物或氟苯尼考等抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療ISKNV病，但效果不佳。也有報(bào)道使用中草藥、黃芪多糖、維生素、免疫多糖等預(yù)防和治療ISKNV病，機(jī)理為激活鱖魚免疫系統(tǒng)，增加鱖魚細(xì)胞免疫和體液免疫，從而預(yù)防ISKNV病害發(fā)生，且具備副作用小、藥殘低等優(yōu)點(diǎn)。ISKNV致病的誘發(fā)或協(xié)同因子包括水體理化指標(biāo)、養(yǎng)殖模式、飼養(yǎng)管理、氣候突變、病原感染、近親繁殖種質(zhì)退化等。預(yù)防鱖魚ISKNV病最安全有效的方法是免疫預(yù)防，根據(jù)鱖魚流行病學(xué)特點(diǎn)，在ISKNV病爆發(fā)季前，可注射滅活疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗來減少病害的發(fā)生和流行。發(fā)現(xiàn)病鱖需及時(shí)隔離及早治療，應(yīng)合理用藥，以減少因抗生素濫用而導(dǎo)致的藥殘現(xiàn)象。

7 鱖魚ISKNV病疫苗

隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全的日益重視，ISKNV病引發(fā)的藥殘問題已成為鱖魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。為踐行生態(tài)友好持續(xù)發(fā)展型漁業(yè)，研發(fā)與ISKNV病原對(duì)應(yīng)的高效鱖魚虹彩病毒疫苗勢(shì)在必行。1997年以來中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所首先采用滅活組織漿疫苗對(duì)鱖魚病毒病進(jìn)行防治，實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示組織漿疫苗可對(duì)鱖魚產(chǎn)生較好的免疫效果，新鮮制備疫苗的保護(hù)率在80%以上，該所連續(xù)6年對(duì)廣東南海等地生產(chǎn)場(chǎng)的種苗、親魚進(jìn)行免疫注射，免疫種苗存活率提高5.6%～40%，免疫親魚子代存活率比未免疫親魚子代存活率普遍高5%～15%，證明免疫是預(yù)防鱖魚ISKNV病的有效途徑。但是鱖魚組織漿疫苗批次間有效抗原含量差異大，效果不穩(wěn)定，疫苗制備困難、推廣較緩。2004年以來珠江水產(chǎn)研究所聯(lián)合中山大學(xué)等科研機(jī)構(gòu)對(duì)鱖虹彩病毒病重組亞單位疫苗開展研究，2004～2016年篩選了多個(gè)抗原基因，制備的重組亞單位疫苗、DNA疫苗實(shí)驗(yàn)室保護(hù)率分別在60%、50%以上，由于尚未找到高保護(hù)性抗原，致使重組亞單位疫苗、DNA疫苗的免疫保護(hù)率仍然低于全病毒滅活疫苗。因此病毒滅活疫苗是依然是目前最常用疫苗。滅活疫苗技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)是構(gòu)建病毒的體外繁殖系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)魚類病毒在細(xì)胞系上大規(guī)模繁殖，輔助實(shí)驗(yàn)室制備或工廠化生產(chǎn)疫苗。2008年中山大學(xué)建立了第一個(gè)對(duì)ISKNV高度敏感的鱖魚仔魚細(xì)胞系（MFF-1），并使用該細(xì)胞系生產(chǎn)出ISKNV滅活疫苗。2015珠江水產(chǎn)研究所建立了對(duì)ISKNV敏感的鱖腦組織細(xì)胞系，分離了多株鱖魚ISKNV，為鱖ISKNV滅活疫苗的創(chuàng)新性研究奠定了基礎(chǔ)。

（作者單位：1.150001黑龍江省水生動(dòng)物資源增殖保護(hù)站；2.164300黑龍江省黑河邊境漁政管理站；3.150030東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖系）