福建省3例輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)診斷分析

林耀瑩，張山鷹，楊發(fā)柱，謝漢國(guó)，歐陽(yáng)榕，陳朱云

卵形瘧最早是1900年Charles F.Craig發(fā)現(xiàn)，1922年Stephens從一個(gè)非洲回英國(guó)的士兵血液里被感染的紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，并正式命名[1]。卵形瘧主要流行于西非、菲律賓、印尼東部和巴布亞新幾內(nèi)亞[2]，孟加拉、柬埔寨、印度、泰國(guó)和越南也有報(bào)道。全球每年大約有1 500萬(wàn)卵形瘧感染，在西非瘧疾病例中卵形瘧超過(guò)10%。卵形瘧通過(guò)基因方法分為兩個(gè)亞種—卵形瘧curtisi和卵形瘧wallikeri[3－4]，兩個(gè)亞種的譜系分離各自發(fā)生在100萬(wàn)和350萬(wàn)年前[5]。Calderaro A 等報(bào)道[1]，流行病學(xué)和生物學(xué)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，卵形瘧與間日瘧形態(tài)相似，蟲(chóng)種密度低，只引起密度相對(duì)低的蟲(chóng)血癥，即使實(shí)在首發(fā)感染，蟲(chóng)密度峰值也低于10 000／μL。隨著前往卵形瘧流行地區(qū)回國(guó)人員的增加以及瘧疾檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，偶爾會(huì)發(fā)現(xiàn)卵形瘧病例和形態(tài)難以區(qū)分的混合感染，甚至是其少見(jiàn)的變異亞種，因此需加強(qiáng)鏡檢技術(shù)培訓(xùn)，并結(jié)合PCR等聯(lián)合診斷，提高檢出率。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集3例輸入性可疑卵形瘧病人（編號(hào)分別為FJ1、FJ2、FJ3）的血片以及濾紙血樣本。鏡檢以吉氏染色為準(zhǔn)，Whatman903濾紙采集末梢全血，留取直徑為1cm濾紙血3滴，干燥后保存在－20。C冰箱。

1.2 病例 FJ1吉林省人，在石獅做生意，2010年12前往加納，2011年10月25日回國(guó)，10月22日在外期間已出現(xiàn)發(fā)冷發(fā)熱癥狀，10月28日就診福州市傳染病院。FJ2建甌人，2010年6月前往加納，2010年8月初回國(guó)，8月22日出現(xiàn)發(fā)熱等癥狀，8月25日就診福州市傳染病院。FJ3福清人，2009年5月前往尼日利亞，2010年1月回國(guó)，此后未離開(kāi)過(guò)福建省，2010年7月21日出現(xiàn)發(fā)冷發(fā)熱等癥狀，病人自述每日發(fā)熱，在當(dāng)?shù)刂嗅t(yī)院按中暑治療后稍好轉(zhuǎn)，8月12日再次出現(xiàn)發(fā)冷發(fā)熱癥狀，8.17就診福州市傳染病院。3例我中心瘧疾實(shí)驗(yàn)室鏡檢初步診斷都為間日瘧感染，當(dāng)年未做PCR確診，但留有血片和濾紙血。

表1 3例病例流行病學(xué)史基本資料Tab.1 Epidemiological information of three cases in this study

1.3 DNA提取 根據(jù)德國(guó)Qiagen的QIAamp DNA Mini kit（250）試劑盒，提取3份濾紙血樣本的DNA，－20。C保存。

1.4 套式PCR擴(kuò)增 參考18SSUrRNA片段[6]進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，第1次擴(kuò)增是通過(guò)瘧原蟲(chóng)屬特異性引物（rPLU6、rPLU5，表2）擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度為1 200bp，第2次擴(kuò)增4種瘧原蟲(chóng)P.vivax，P.falciparum，P.malariae，P.ovalecurtisi的種特異產(chǎn)物 （rFAL1、rFAL2，rVIV1、rVIV2，rMAL1、rMAL2，rOVA1、rOVA2，表3），四種瘧原蟲(chóng)的預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別是120bp，205bp，144bp，800 bp。

第1輪擴(kuò)增：20μL反應(yīng)體系中包括模板DNA3.0μL，0.5μL Taq聚合酶（5U／μL），各1.0 μL屬 特 異 性 引 物 （10μmol／L），0.4μL dNTPs（10mmol／L），2.0μL 10×Buffer，2.0μL Mg2＋（25 mmol／L）。擴(kuò)增條件：94。C變性3min；94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸1min，共擴(kuò)增34個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min。

第2輪擴(kuò)增：20μL體系中包括第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物2.0μL，0.5μL Taq聚合酶（5U／μL），各1.0μL 4對(duì)種特異性引物上、下游引物（10μmol／L），0.4μL dNTPs（10mmol／L），2.0μL 10×Buffer，2.0μL Mg2＋（25mmol／L）。擴(kuò)增條件與第1輪相同。

表2 屬特異性引物Tab.2 Generic specific primers

1.4 產(chǎn)物電泳 取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，與2μL的上樣緩沖液混勻后，加樣于2%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠5μg／mL）電泳，80V電泳約30min，凝膠分析儀進(jìn)行觀察和分析。

表3 4對(duì)種特異性引物Tab.3 Four couples of specific primers

2 結(jié) 果

2.1 鏡檢

2.1.1 樣本FJ1 在圖1A中可見(jiàn)較為典型的卵形瘧原蟲(chóng)滋養(yǎng)體，胞漿不規(guī)則，未見(jiàn)寄生紅細(xì)胞脹大，但仍可見(jiàn)稍不明顯的鋸齒形；圖1B可見(jiàn)卵形瘧原蟲(chóng)裂殖體，且有12個(gè)左右的裂殖子不規(guī)則分布，顆粒呈深棕色；圖1C可見(jiàn)一個(gè)紅細(xì)胞中含有兩個(gè)環(huán)狀體，可能為惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)狀體，由于未見(jiàn)惡性瘧配子體，故很難確定，需要進(jìn)一步基因分析診斷（圖A、C為薄血膜，B圖為厚血膜）

2.1.2 樣本FJ2 圖2可見(jiàn)典型的卵形瘧原蟲(chóng)滋養(yǎng)體，寄生紅細(xì)胞脹大，空泡、薛氏點(diǎn)清晰明顯，瘧色素呈棕黃色，散在胞漿分布；圖E小配子體，呈圓形，瘧色素均勻明顯，寄生紅細(xì)胞未脹大，可見(jiàn)均勻散在薛氏點(diǎn)。鏡下整體紅細(xì)胞鋸齒狀不明顯，有散在環(huán)狀體出現(xiàn)，但數(shù)量不多，制片質(zhì)量差，雜質(zhì)多，攝影設(shè)備較落后等原因，故未列出圖片（圖為薄血膜）

2.1.3 樣本FJ3 圖3可見(jiàn)典型的卵形瘧原蟲(chóng)滋養(yǎng)體，寄生紅細(xì)胞變大，鋸齒狀十分明顯，瘧色素顆粒清晰可見(jiàn)。圖G為卵形瘧原蟲(chóng)雄配子體，呈卵圓形，核疏松偏一側(cè)，胞漿深藍(lán)色，瘧色素棕黃色偏暗，在胞漿上散在分布。樣本未見(jiàn)其它時(shí)期形態(tài)（薄血膜）

圖1 鏡下卵形瘧原蟲(chóng)形態(tài)Fig.1 Morphology of P.ovalein microscope

圖2 鏡下卵形瘧原蟲(chóng)形態(tài)Fig.2 Morphology of P.ovalein microscope

圖3 鏡下卵形瘧原蟲(chóng)形態(tài)Fig.3 Morphology of P.ovalein micnoscope

圖4 PCR電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis result of PCR

2.2 PCR檢測(cè) 將4對(duì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，然后電泳，并設(shè)惡性瘧、間日瘧陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)FJ1、FJ2有產(chǎn)生惡性瘧及卵形瘧位置的2條帶，F(xiàn)J3只有卵形瘧位置的1條帶。證實(shí)FJ1和FJ2是卵形瘧亞種curtisi和惡性瘧混合感染，F(xiàn)J3是單一卵形瘧亞種curtisi感染，見(jiàn)圖4。

2.3 測(cè)序結(jié)果 通過(guò)上海生工測(cè)序，F(xiàn)J1擴(kuò)增產(chǎn)物與登錄號(hào)為KC633226.1卵形瘧分離株ZJ04ssr－RNA基因以及登錄號(hào)為AB182489.1卵形瘧ssr－RNA完整序列的經(jīng)典亞種有99%的一致性。FJ2擴(kuò)增產(chǎn)物與登錄號(hào)為KC633226.1卵形瘧分離株ZJ04ssrRNA基因一致性為99%。FJ3擴(kuò)增產(chǎn)物與登錄號(hào)為AB182489.1卵形瘧ssrRNA完整序列的經(jīng)典亞種有98%的一致性。

表4 測(cè)序結(jié)果信息Tab.4 Result of sequencing

3 討 論

由于歷史上福建省卵形瘧報(bào)道較少，卵形瘧血片與相關(guān)培訓(xùn)少，形態(tài)易與間日瘧混淆，3例鏡檢都誤診為間日瘧。在回顧性復(fù)核時(shí)發(fā)現(xiàn)FJ1、FJ2除了具有卵形瘧原蟲(chóng)的形態(tài)特點(diǎn)外，鏡檢未見(jiàn)惡性瘧配子體，且環(huán)狀體密度低難以與其它蟲(chóng)種區(qū)分等，導(dǎo)致惡性瘧均未檢出，出現(xiàn)混合感染漏診，需要PCR確診。FJ2制片染色較差。FJ3有卵形瘧原蟲(chóng)的典型特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的熟練鏡檢員不致于誤診。國(guó)內(nèi)卵形瘧誤診漏診等情況也有多家報(bào)道。師永霞等[7]2011年報(bào)道1例來(lái)自赤道幾內(nèi)亞輸入性卵形瘧血樣初次鏡檢陰性，通過(guò)鏡檢復(fù)核和PCR擴(kuò)增后，發(fā)現(xiàn)該病例為卵形瘧感染，顯示PCR檢測(cè)的必要。姚立農(nóng)等[8]在2014年報(bào)道的浙江省5例來(lái)自非洲的輸入性瘧疾誤診病例中，發(fā)現(xiàn)在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)鏡檢初步都診斷為間日瘧，后經(jīng)復(fù)核和PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)為卵形瘧感染。3例卵形瘧除了來(lái)自烏干達(dá)的FJ3為單一感染卵形瘧外，其它2例都伴有惡性瘧感染，因此要加強(qiáng)對(duì)西非等歸國(guó)人員瘧疾知識(shí)的宣傳和關(guān)注，避免少見(jiàn)類型、形態(tài)難以區(qū)分混合類型、癥狀嚴(yán)重的惡性瘧的誤診、漏診等。由于肝細(xì)胞期休眠子的潛伏期不同，導(dǎo)致一系列復(fù)發(fā)的可能，有些肝細(xì)胞期存在延遲發(fā)育，有報(bào)道可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)發(fā)生在感染后4年出現(xiàn)，應(yīng)提醒病人不要忽視復(fù)發(fā)的存在。

隨著經(jīng)濟(jì)全球化，出國(guó)交流、務(wù)工、經(jīng)商的人越來(lái)越多，出現(xiàn)越來(lái)越多的來(lái)自非洲、東南亞、南美洲的輸入性瘧疾，也給中國(guó)帶來(lái)更多少見(jiàn)和罕見(jiàn)瘧疾類型，如三日瘧，卵形瘧（經(jīng)典亞種P.ovalecurtisi和變異亞種P.ovalewallikeri）[9]以及諾氏瘧原蟲(chóng)等。雖然兩個(gè)亞種的分型鑒別目前仍在研究討論中[4，10－11]，但是必須要加強(qiáng)和借鑒全球瘧疾專家和學(xué)者的研究，完善診斷檢測(cè)方法，真正了解全球瘧疾的分布流行。

[1]Calderaro A，Piccolo G，Gorrini C，et al.A new real－time PCR for the detection ofPlasmodiumovalewallikeri[J].PLoS ONE，2012，7（10）：e48033.DOI：10.1371／journal.pone.0048033

[2]Zhou RM，Zhang HW，Deng Y，et al.Laboratory detection on two cases with importedPlasmodiumovaleinfection[J].Chin J Parasit Dis Ctrl，2013，31（2）：127－129.（in Chinese）周瑞敏，張紅衛(wèi)，鄧艷，等.2例輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2013，31（2）：127－129.

[3]Calderaro A，Piccolo G，Perandin F，et al.Genetic polymorphisms influencePlasmodiumovalePCR detection accuracy[J].J Clin Microbiol，2007，45（5）：1624－1627.DOI：10.1128／JCM.02316－06

[4]Li M，Xia ZG，Tang LH.Overviews onPlasmodiumovalewallikeriand its genetic detection system[J].Chin J Parasit Dis Ctrl，2014，32（1）：64－67.（in Chinese）李美，夏志貴，湯林華.卵形瘧原蟲(chóng)wallikeri亞種及其基因檢測(cè)體系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2014，32（1）：64－67.

[5]Putaporntip C，Hughes AL，Jongwutiwes S，et al.Low level of sequence diversity at merozoite surface protein－1locus ofPlasmodiumovalecurtisiandP.ovalewallikerifrom Thai isolates[J].PLoS One，2013，8（3）：e58962.DOI：10.1371／journal.pone.005 8962

[6]Snounou G，Viriyakosol S，Zhu XP，et al.High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction[J].Mol Biochem Parasitol，1993，61（2）：315－320.

[7]Shi YX，Huang JC，Su JK，et al.Laboratory diagnosis of a suspected case of importedPlasmodiumovaleinfection[J].Chin J Zoonoses，2011，27（10）：914－920.（in Chinese）師永霞，黃吉城，蘇錦坤，等.1例國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)的輸入性卵形瘧的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2011，27（10）：914 920.

[8]Yao LN，Zhang LL，Ruan W，et al.Species identification in 5 imported cases previously diagnosed asVivaxmalaria by parasitological and nested PCR techniques[J].Chin J Parasitol Parasit Dis，2013，31（3）：221－234.（in Chinese）姚立農(nóng)，張玲玲，阮衛(wèi)，等.浙江省5例輸入性瘧疾誤診病例的病原學(xué)診斷分析[J].中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2013，31（3）：221－234.

[9]Li YC，Wang GZ，Sun DW，et al.A case ofPlasmodiumovale wallikeriinfection in a Chinese worker returning from West Africa[J].Korean J Parasitol，2013，51（5）：557－562.DOI：10.3347／kjp.2013.51.5.557

[10]Tanomsing N，Imwong M，Sutherland CJ，et al.Genetic marker suitable for identification and genotyping ofPlasmodium ovalecurtisiandPlasmodiumovalewallikeri[J].J Clin Microbiol，2013，51（12）：4213－4216.DOI：10.1128／JCM.01527－13

[11]Fuehrer HP，Stadler MT，Buczolich K，et al.Two techniques for simultaneous identification ofPlasmodiumovalecurtisiandPlasmodiumovalewallikeriby use of the small－subunit rRNA gene[J].J Clin Microbiol，2012，50（12）：4100－4102.DOI：10.1128／JCM.02180－12