近紅外到近紅外Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子的制備及其生物成像

羅 陽， 廖正芳， 張 偉， 左 芳

(西南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境保護工程學(xué)院， 四川 成都 610041)

1 引 言

近些年，隨著生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，可視化的生物成像技術(shù)在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了越來越多的關(guān)注。對比其他生物成像技術(shù)，熒光成像具有價格低廉、快速成像等優(yōu)點[1]。但是傳統(tǒng)的熒光探針材料(如熒光染料、量子點)由于其吸收和發(fā)射較寬，Stokes位移小，光穩(wěn)定性差，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定等，限制了其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用[2-3]。

另一方面，稀土離子上轉(zhuǎn)換熒光納米材料由于其獨特的性質(zhì)在生物成像領(lǐng)域受到了研究者的關(guān)注。該材料可以吸收兩個或兩個以上的低能量光子而輻射一個高能量光子。此外由于近紅外光(700～1 100 nm)處在“生物窗口”范圍內(nèi)，可以避免對生物組織的損傷，減少生物組織的自發(fā)熒光，并提高其組織穿透力[4]。而Yb3+/Tm3+摻雜的NaYF4納米材料可將近紅外光(980 nm)轉(zhuǎn)變?yōu)榻t外光((800±10) nm),具有強的組織穿透力，因而受到了廣泛的關(guān)注[5-6]。另有相關(guān)報道指出，通過摻雜過渡金屬Mn2+來調(diào)節(jié)NaYF4∶Yb3+/Er3+納米粒子從六方晶相，轉(zhuǎn)變?yōu)榧兞⒎骄啵瑢崿F(xiàn)相的轉(zhuǎn)變[7]。

此外，可用于生物成像的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料要滿足以下幾個條件：具有水溶性，并具有一定的生物兼容性。在本工作中，我們首先采用水熱法合成了油酸修飾的Mn2+摻雜NaYF∶Yb3+/Tm3+納米粒子，并將兩親性配體(C18PMH-mPEG)修飾到納米粒子表面從而得到具有水溶性的納米粒子[8-9]。最后，通過細胞毒性實驗評價了水性修飾后Mn2+摻雜NaYF∶Yb3+/Tm3+納米粒子的生物相容性，并在小鼠體內(nèi)進行了近紅外生物成像。

2 實 驗

2.1 試劑與儀器

實驗中使用的試劑主要有：油酸(OA，質(zhì)量分數(shù)98%)，分析純(AR)，天津市致遠化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉(NaOH)，分析純(AR)，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；無水乙醇(CH3CH2OH，質(zhì)量分數(shù)99.7%)，分析純(AR)，成都海興化工試劑廠；硝酸鐿(Yb(NO3)3·5H2O)，硝酸釔(Y(NO3)3·6H2O)，硝酸銩(Tm(NO3)3)，均為分析純(AR)，成都貝斯特試劑有限公司；氟化鈉(NaF)，分析純(AR)，成都市科龍化工試劑廠；氯仿(質(zhì)量分數(shù)99%)，分析純(AR)，成都市科龍化工試劑廠；二氯甲烷(CH2Cl2，質(zhì)量分數(shù)99.5%)，分析純(AR)，天津市富宇精細化工有限公司；三乙胺(TEA)，分析純(AR)，成都市科龍化工試劑廠；聚(馬來酸酐-alt-1-十八碳烯)(C18PMH)，Sigma-Aldrich Co.LLC.(USA)；甲氧基聚乙醇胺(mPEG-NH2)，上海阿拉丁生化科技有限公司；1-乙基-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，成都貝斯特試劑有限公司；透析袋MD36(MW：8 000～14 000)，Biosharp公司；實驗用水為二次蒸餾水。

實驗中使用的儀器主要有：TECNAI F20 透射電子顯微鏡(TEM)； ZETASIZERNANO ZS90動態(tài)光散射(DLS)儀，英國MALVERN公司；XD-6型X射線衍射儀(XRD)，北京普析通用儀器有限公司；FLUOROLOG-3型熒光分光光度計；PERKIN-ELMER1700傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)。

2.2 實驗方法

2.2.1 油酸修飾的Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/ Tm3+納米粒子的合成

采用水熱法合成油酸修飾的Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子[7,10]。稱取0.99 g NaOH溶于33.3 mL無水乙醇中，將溶液倒入架好裝置的三口燒瓶中，再加入16.65 mL OA和5 mL H2O進行攪拌。攪拌均勻后，分別量取3.32 mL Y(NO3)3·6H2O溶液(0.5 mol/L)、3 mL Yb(NO3)3·5H2O溶液(0.2 mol/L)、0.33 mL Tm(NO3)3溶液(0.2 mol/L)、2 mL MnCl2·4H2O溶液(0.5 mol/L)，混合后加入上述三口燒瓶中。再將2.41 mol/L NaF溶液緩慢加到三口燒瓶中，之后攪拌30 min。最后將反應(yīng)液移入聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜放入烘箱中200 ℃下反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，離心分離，將底部固體產(chǎn)物用無水乙醇和水(V(乙醇)∶V(水)=1∶1)洗滌幾遍，干燥后即得油酸修飾的Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子樣品(OA-UCNPs)。

圖1 C18PMH-mPEG修飾的Mn2+摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的制備流程圖

2.2.2 Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子的表面改性

本文參照此前的工作合成兩親性聚合物C18PMH-mPEG[8]。稱取 50 mg C18PMH- mPEG和50 mg OA-UCNPs溶于25 mL 氯仿中室溫下攪拌2 h。之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉氯仿，將所得到的白色固體產(chǎn)物分散于15 mL去離子水中，0.22 μm 膜過濾器過濾，然后將獲得水溶性C18PMH-mPEG修飾的Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子(mPEG-UCNPs)，并室溫儲存。

2.2.3 MTT實驗

細胞存活率用典型的MTT法增值實驗檢測[11-12]。收集對數(shù)期生長的HeLa細胞，離心洗滌。稀釋HeLa細胞至106/mL接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔含細胞約5×104個，繼續(xù)培養(yǎng)10 h。加入含有不同濃度的mPEG-UCNPs培養(yǎng)基溶液，與HeLa細胞共同孵育培養(yǎng)24 h后，酶標儀器測定490 nm波長的吸光度，MTT法確定各個孔的細胞存活率。

2.2.4 生物成像實驗

首先，100 μL mPEG-UCNPs(0.5 mg/mL)水溶液皮內(nèi)注射到裸鼠皮下組織。用兩個外部可調(diào)的連續(xù)980 nm激光器(0～5 W)(Shanghai Connet Fiber Optics Co., China)作為激發(fā)光源，然后用一個Andor DU897 EMCCD相機作為信號采集器。最后利用柯達分子成像軟件對熒光信號的圖像進行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的透射電鏡及粒徑分布表征

Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子在水性修飾前后的透射電鏡照片(TEM)如圖2所示。圖2(a)為油酸修飾的Mn2+摻雜 NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子分散于氯仿中的TEM圖，從圖中可以看出OA-UCNPs具有較好的分散性，形貌為立方形。從粒徑分布圖2(c)中可以看出OA-UCNPs粒徑分布較窄，水合力學(xué)粒徑約為39.35 nm。圖2(b)為水溶性mPEG-UCNPs的TEM圖，圖中可以看出納米粒子經(jīng)過修飾后仍然保持了原有的形貌及較好的分散性，說明C18PMH-mPEG包覆的納米粒子具有較高的穩(wěn)定性。從粒徑分布圖2(d)中可以看出它們的水合力學(xué)粒徑約為41.54 nm。

圖2 油酸修飾(a)及C18PMH-mPEG修飾(b)的Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子TEM圖和DLS圖

3.2 Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的XRD衍射圖譜分析

圖3 油酸修飾(a)及C18PMH-mPEG修飾(b)的 Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的XRD圖

3.3 Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的FTIR光譜分析

圖4 油酸修飾(a)及C18PMH-mPEG修飾(b)的Mn2+ 摻雜 NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+ 納米粒子的紅外光譜圖

3.4 Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的熒光光譜分析

Mn2+摻雜 NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子由于其發(fā)光性質(zhì)穩(wěn)定，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可以用于生物熒光分析和生物成像，因此必須要保證其水性化后發(fā)光性質(zhì)不受mPEG影響。圖5為Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子在980 nm近紅外光激發(fā)下所得的熒光光譜圖。從圖5(a)中可以看出，油酸修飾的Mn2+摻雜 NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子在(800±10) nm處發(fā)出很強的近紅外光波長(3H4→3H6)，與沒有摻雜Mn2+的NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子(圖5(c))相比較，其熒光強度明顯增加，表明摻雜Mn2+可以明顯增強NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子的熒光強度，這與相關(guān)文獻所報道的結(jié)果一致[15]。而經(jīng)過兩親性聚合物修飾后，從圖5(b)可以看到mPEG-UCNPs仍保持著原有的發(fā)光位置，發(fā)射峰沒有移動，但是整體熒光強度比水性修飾前要低，熒光強度降低了1/2左右，可能的原因是由于水分子存在所導(dǎo)致的猝滅效應(yīng)[16]。

圖5 油酸修飾(a)、C18PMH-mPEG修飾(b)的Mn2+ 摻雜 NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+ 納米粒子及油酸修飾NaYF4∶Yb3+/Tm3+ 納米粒子(c)的熒光光譜圖。

圖6為Mn2+摻雜 NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子在980 nm 激發(fā)下的能量傳遞過程。Yb3+離子吸收980 nm 激發(fā)能并通過能量傳遞使鄰近的Tm3+離子躍遷到激發(fā)態(tài)3H5、3F2、1G4和1D2能級上，而Tm3+的激發(fā)態(tài)1G4和1D2和處于激發(fā)態(tài)(4T1)的Mn2+之間發(fā)生無輻射能量轉(zhuǎn)移， 隨后Mn2+又將能量傳遞給Tm3+的激發(fā)態(tài)3F2，激發(fā)態(tài)3F2先返回到低能級的激發(fā)態(tài)1H4，隨后無輻射弛豫返回基態(tài)3H6從而使得納米粒子的熒光強度增大。

圖6 Mn2+摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+ 納米粒子的980 nm 激發(fā)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程能級圖

3.5 C18PMH-mPEG修飾的Mn2+摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的細胞毒性

兩親性聚合物C18PMH-mPEG除了用來改善Mn2+摻雜 NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子的水溶性外，還進一步賦予了納米粒子在生物領(lǐng)域方面的應(yīng)用潛力。本文中我們調(diào)查了mPEG-UCNPs的生物相容性。從圖7中可以看到，我們將不同濃度的mPEG-UCNPs(0.062 5～0.5 mg/mL)與Hela細胞共同培養(yǎng)24 h后，mPEG-UCNPs展現(xiàn)了良好的生物相容性，即使在最高濃度為0.5 mg/mL時，細胞的存活率也達到了89%左右。這使得mPEG-UCNPs在應(yīng)用于生物領(lǐng)域方面具備了一定的前提條件。

圖7 C18PMH-mPEG修飾的Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+ 納米粒子的細胞毒性

3.6 C18PMH-mPEG修飾的Mn2+ 摻雜 NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+納米粒子的生物成像

接下來，我們考察mPEG-UCNPs在近紅外光下的生物熒光成像能力，首先將100 μL 0.5 mg/mL mPEG-UCNPs皮下注射到一個被麻醉的5周齡老鼠(雄) 腹部進行生物成像。如圖8所示，生物熒光成像照片用EMCCD相機在注射部位采集(800±10) nm近紅外發(fā)射信號得到，此外，近紅外成像信號的信噪比達到了～38，在同等強度的熒光條件下，相比于(660±10) nm波長的紅光，(800±10) nm 波長的近紅外光對于生物組織具有更強的穿透力,其抗干擾能力更強[17-18]，所以在生物體內(nèi)進行熒光成像更具有優(yōu)勢。

圖8 C18PMH-mPEG修飾的Mn2+ 摻雜NaYF4 ∶Yb3+/Tm3+ 納米粒子的生物成像

4 結(jié) 論

本文采用水熱法合成近紅外到近紅外的Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子，XRD結(jié)果表明樣品為立方相(α-NaYF4)結(jié)構(gòu)。 TEM照片顯示水性化前后的納米粒子都具有較好的分散性。然后在980 nm近紅外光源激發(fā)下，在(800±10) nm附近得到了強的近紅外光發(fā)射(3H4→3H6)。并對水性修飾后的Mn2+摻雜NaYF4∶Yb3+/Tm3+納米粒子進行了實驗，結(jié)果表明所制得的納米粒子具有良好的生物相容性。然后進一步在小鼠體內(nèi)進行了近紅外熒光成像，較高的信噪比表明其在生物成像領(lǐng)域?qū)⒕哂幸欢ǖ膽?yīng)用前景。