IL-33敲除對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞極化的影響

何小麗， 吳林青， 許偉群， 鄭晨華， 傅冷西， 章 濤

白細(xì)胞介素-33(interleukin-33, IL-33)是一個(gè)于2005年新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，作為磺基轉(zhuǎn)移酶同源體(homolog of sulfotransferase, ST2)的配體，具有前炎癥細(xì)胞因子和核因子的雙重作用[1-2]。其受體ST2選擇性地表達(dá)在Th2上，而Th1上不表達(dá)。IL-33與受體ST2結(jié)合后，激活下游信號(hào)分子，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子IL-4，IL-5和IL-13的產(chǎn)生[1]，促進(jìn)Th2的免疫反應(yīng)，趨化嗜酸性粒細(xì)胞，改變巨噬細(xì)胞(macrophage, Mφ)的極化趨勢(shì)，在多種炎癥性疾病中發(fā)揮作用[3-6]。

Mφ在不同的微環(huán)境及不同因子的作用下可被激活成不同的表型，是一種具有復(fù)雜的異質(zhì)性和多樣性功能的細(xì)胞。根據(jù)極化后細(xì)胞的表面標(biāo)志性分子及功能的不同，Mφ大體可分為經(jīng)典激活的Mφ(M1型)和替代激活的Mφ(M2型)2個(gè)亞群。M1型細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)，分解L-精氨酸，產(chǎn)生NO及活性氧中間物，具有抗病原微生物和腫瘤細(xì)胞的作用，高效提呈抗原，是激活Th1細(xì)胞反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，以CD68+，CD86+及MHCⅡ+為表型特征[7-9]。而M2型則高表達(dá)1型精氨酸酶(arginase-1，Arg-1)、甘露糖受體(CD206)、YM-1(幾丁質(zhì)酶家族成員)及IL-10等，低表達(dá)IL-12；通過高表達(dá)的Arg-1分解L-精氨酸產(chǎn)生L-鳥氨酸，促進(jìn)膠原合成、修復(fù)損傷組織。iNOS和Arg-1二者競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合L-精氨酸，最終通過代謝產(chǎn)物發(fā)揮促炎或抗炎的相反作用[10-12]。

研究顯示，IL-33在Mφ的極化中起重要作用，主要通過IL-13/IL-4Rα-STAT6途徑激活Mφ，促使Mφ向M2型極化，抑制Th1免疫反應(yīng)，促進(jìn)損傷組織修復(fù)、重構(gòu)和血管生長(zhǎng)功能[13-16]。因此，本研究以IL-33-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(peritoneal macrophage,pMφ)為靶點(diǎn)，研究IL-33-/-對(duì)小鼠pMφ 極化的影響，為后期進(jìn)一步探討IL-33-/-對(duì)弓形蟲感染誘導(dǎo)小鼠pMφ 極化的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雌性C57BL/6野生型(WT)和IL-33-/-小鼠各 48只，鼠齡12～14周，體質(zhì)量22～25 g；ICR小鼠30只，鼠齡5～7周，體質(zhì)量18～20 g。C57BL/6 WT小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002，合格證號(hào)：2015000509916, 2015000518671];C57BL/6 IL-33-/-小鼠為日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)部Susumu Nakae教授惠贈(zèng)，并由福建中醫(yī)藥大學(xué)林煒教授提供，與ICR小鼠一起飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(閩)2012-0001，適用范圍：SPF級(jí)鼠類]動(dòng)物房SPF層流柜中，鼠籠、鼠料、墊料、飲水均經(jīng)過高壓消毒滅菌，每周墊料更換2次，動(dòng)物使用協(xié)議由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2試劑及儀器 引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD80，Rat IgG2b，PE anti-Mouse TLR4，PE-anti-Mouse MHCⅡ，F(xiàn)ITC-anti-mouse CD14，F(xiàn)ITC-anti-mouse TLR2，κIsotype Ctrl PE/ Rat IgG2a，κIsotype Ctrl APC(美國(guó)eBiosciences公司)；APC anti-mouse CD206及APC anti-mouse CD86(美國(guó)Biolegend公司)；RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；Mouse IL-10，IL-12，TNF-α ELISA kit(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；Griess Reagent System (美國(guó)Promega公司)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)Fermentas公司)；SYBR Green Master(美國(guó)Roche公司)。溫度梯度PCR儀(德國(guó)Eppendorf 公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 15R，香港Heal Force Development有限公司)；酶標(biāo)儀(Multiscan FC)、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma 3111型)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Mx3005p實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ND2000C，美國(guó)StrataGene公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；超凈臺(tái)(蘇州蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司)；超低溫冰箱(英國(guó)NBS公司)。

1.3方法

1.3.1小鼠基因型的鑒定 采用Oboki設(shè)計(jì)的引物[17]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，提取小鼠鼠尾DNA，PCR鑒定小鼠基因型。

表1 C57BL/6 WT及IL-33-/-小鼠基因型鑒定引物

WT：野生型；IL-33-/-：白細(xì)胞介素33敲除.

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分2組，分別為 IL-33-/-組和WT組，每組6只，參照文獻(xiàn)[18]的方法收集WT和 IL-33-/-小鼠的 pMφ，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞，復(fù)孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；洗去未貼壁的細(xì)胞，加入 1 mL新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h；吸取培養(yǎng)上清液，離心、分裝、凍存于-70 ℃，用于 NO，TNF-α，IL-10及IL-12的檢測(cè)；收集細(xì)胞進(jìn)行Real-time PCR和流式檢測(cè)。

1.3.3pMφ iNOS，Arg-1，IL-1，IL-10及IL-12 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 2組均取培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞，經(jīng)Trizol裂解、提取RNA、D(260 nm)/D(280 nm)下測(cè)定其濃度和純度；采用20 μL反應(yīng)體系，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；按FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)說明書進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)iNOS，Arg-1，IL-1，IL-10及IL-12 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表2。PCR擴(kuò)增條件為50 ℃ 2 min→95 ℃預(yù)變性10 min→(95 ℃變性15 s→60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)體系)→95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，用ΔCt法進(jìn)行計(jì)算，2-ΔΔCt的意義是實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組目的基因表達(dá)量變化的倍數(shù)，WT組為對(duì)照組。

ΔCt=Ct目的基因-Ct參照基因

ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct參照基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct參照基因)對(duì)照組

1.3.4pMφ TNF-α，IL-10及IL-12分泌水平檢測(cè) 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)技術(shù)，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5pMφ NO分泌水平檢測(cè) 采用Griess方法檢測(cè)，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

表2 Real-time PCR引物表

IL-1β：白細(xì)胞介素1β； iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶； IL-12：白細(xì)胞介素12； IL-10：白細(xì)胞介素10； Arg-1：1型精氨酸酶； β-actin：β-肌動(dòng)蛋白.

1.3.6pMφ表面分子(CD80,CD86,CD206,TLR4,TLR2及MHCⅡ)表達(dá)水平檢測(cè) 胰酶消化收集2組細(xì)胞，洗滌后，加入含封閉抗體(CD16/32)的細(xì)胞洗液80 μL，混勻，冰浴10 min；加入各管相應(yīng)的Ab(CD80/CD206/TLR4；CD86/MHCⅡ/TLR2)20 μL，漩渦混勻，4 ℃避光35 min；加入1%多聚甲醛的PBS固定液固定，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用GraphPad Prism 5制圖。采用獨(dú)立樣本成組t檢驗(yàn)進(jìn)行分析驗(yàn)證。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1小鼠基因型鑒定 經(jīng)PCR鑒定，本實(shí)驗(yàn)用小鼠為C57BL/6 WT和IL-33-/-小鼠。

2.2小鼠pMφ 純度鑒定 FITC-CD14染色檢測(cè)純度約為95%(圖1)。

A:CD14 FITC標(biāo)記； B：同型對(duì)照.圖1 小鼠pMφ鑒定Fig 1 Identification of pMφ

2.3IL-33-/-對(duì)小鼠pMφ M1型標(biāo)志物表達(dá)的影響 IL-33-/-小鼠pMφ上清液中NO的濃度及細(xì)胞表面分子MHCⅡ，TLR4及CD86的陽性百分率高于WT組 (NO，CD86 和MHCⅡ ，P<0.01；TLR4 ，P<0.05)，提示IL-33-/-促進(jìn)小鼠pMφ分泌NO，高表達(dá)MHCⅡ，CD86和TLR4分子(圖2，3)。IL-33-/-對(duì)小鼠pMφ iNOS，IL-1，IL-12 mRNA及TNF-α，CD80，TLR2的表達(dá)未見影響(P>0.05)。

2.4IL-33-/-對(duì)小鼠pMφ M2型標(biāo)志物表達(dá)的影響 IL-33-/-小鼠pMφ IL-10的分泌高于WT組(P<0.05，圖3)，提示IL-33-/-促進(jìn)小鼠pMφ IL-10的表達(dá)。IL-33-/-對(duì)小鼠pMφ Arg-1，IL-10 mRNA及CD206的表達(dá)未見影響(P>0.05)。

n=6. CD80：分化抗原80；CD86：分化抗原86；TLR4：Toll樣受體4；TLR2：Toll樣受體2；MHCⅡ：主要組織相容性Ⅱ類分子；CD206：甘露糖受體. 2組間比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.圖2 M1/M2型pMφ表面分子表達(dá)比較Fig 2 Expression of M1/M2 surface marks in pMφ

A：NO濃度；B：IL-10濃度. n=10. NO：一氧化氮；IL-10：白細(xì)胞介素10. 2組間比較，☆：P<0.05；☆☆：P<0.01.圖3 小鼠pMφ NO及IL-10濃度比較Fig 3 Secretion of NO and IL-10 in pMφ

3 討 論

研究顯示，IL-33/ST2在先天性及抗原誘導(dǎo)性的氣道反應(yīng)性炎癥中，可驅(qū)動(dòng)肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophags, AM)向M2a亞群極化，IL-13/IL-4Rα信號(hào)通路在這一極化過程中起關(guān)鍵作用。IL-33放大了這一極化過程，增加了M2a標(biāo)志物Arg-1，CD206，YM-1及趨化因子CCL24和CCL17的表達(dá)，去除AM，可減輕氣道炎癥反應(yīng)[12]。Jackson-Jones等在研究真菌抗原誘導(dǎo)的過敏性炎癥和線蟲感染中也證實(shí)，IL-33誘導(dǎo)的Mφ的替代激活依賴于漿膜腔中的IL-4Rα，而Mφ的增殖不依賴于IL-4Rα[15]。在小鼠實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾(experimental cerebral malaria, ECM)的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-33通過促進(jìn)Th2型的先天性淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，IL-5及IL-13等2型細(xì)胞因子，驅(qū)動(dòng)Mφ向M2型極化，后者再影響Tregs，最終抑制Th1免疫反應(yīng)，減少IFN-γ及TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，抑制ECM病程的進(jìn)展[16]。最新研究也證實(shí)，在柯薩奇病毒引起的心肌炎和三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的腸炎中，IL-33通過誘導(dǎo)Mφ向M2亞群極化，從而減輕炎癥發(fā)展[4-5]。因此，本研究以IL-33-/-小鼠pMφ為靶點(diǎn)，研究IL-33-/-對(duì)小鼠pMφ極化的影響，為后期進(jìn)一步探討IL-33-/-對(duì)弓形蟲感染誘導(dǎo)小鼠pMφ極化的影響奠定基礎(chǔ)。

本研究分別收集未經(jīng)誘導(dǎo)的IL-33-/-小鼠和WT小鼠pMφ，于體外培養(yǎng)48 h后，同時(shí)檢測(cè)2組pMφ各細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的分泌濃度、細(xì)胞表面標(biāo)志性分子的陽性百分率，以便客觀分析IL-33-/-對(duì)小鼠的pMφ極化的影響。pMφ培養(yǎng)上清液中，IL-33-/-組小鼠的NO濃度明顯高于WT組，由于NO具有殺傷病原微生物的作用，提示IL-33-/-可能增強(qiáng)了小鼠pMφ的抗炎活性。本研究結(jié)果顯示，IL-33-/-組小鼠pMφ iNOS，IL-1，IL-10，IL-12及Arg-1 mRNA表達(dá)水平與WT組比較無明顯變化(P>0.05)，而IL-33-/-小鼠pMφ培養(yǎng)上清液中NO和IL-10濃度明顯升高，可能與檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)延后有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在誘導(dǎo)Mφ 4 h后，Real-time PCR檢測(cè)RNA表達(dá)有明顯變化[19]。

T細(xì)胞的活化依賴于雙信號(hào)的識(shí)別和細(xì)胞因子的參與。MHCⅡ類分子為CD4+T細(xì)胞激活第一信號(hào)中的關(guān)鍵分子，而CD86作為CD28的配體，為T細(xì)胞激活提供了第二激活信號(hào)(即共刺激信號(hào))。IL-33-/-組小鼠pMφ表面MHCⅡ類分子和CD86分子的陽性百分率明顯高于WT組(P<0.01)，提示IL-33-/-可能增強(qiáng)了CD4+T細(xì)胞激活的雙信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。

Toll樣受體是一類可識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的病原體相關(guān)分子模式的跨膜受體，主要通過啟動(dòng)TLR/MyD88信號(hào)傳導(dǎo)途徑[20]，誘導(dǎo)某些免疫效應(yīng)分子(包括炎性細(xì)胞因子)的表達(dá)，在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和介導(dǎo)炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21-22]。TLR2和TLR4均可在髓系單核細(xì)胞上表達(dá)。IL-33-/-組小鼠pMφ TLR4表達(dá)高于WT組，而對(duì)TLR2的表達(dá)無影響。本研究在探討IL-33-/-對(duì)弓形蟲感染誘導(dǎo)小鼠pMφ極化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-33-/-和弓形蟲感染協(xié)同抑制了TLR2分子的表達(dá)，而對(duì)TLR4則無影響[23]，具體原因還有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，IL-33-/-促進(jìn)了小鼠pMφ高表達(dá)CD86，TLR4及MHCⅡ類分子，上調(diào)NO的分泌，總體符合M1型細(xì)胞特征，提示IL-33-/-可驅(qū)動(dòng)小鼠pMφ向M1型極化。IL-33在Mφ分化調(diào)控和免疫調(diào)節(jié)中的作用尚不清楚[24]，有待后續(xù)進(jìn)一步探索。