胃癌患者循環(huán)中OCT4表達(dá)水平與臨床病理特征及生存率的關(guān)聯(lián)分析

田 浩， 高 峽， 王雪堯， 馬 翾

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，據(jù)2015年全球腫瘤流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告顯示，2012年全球約有951 600新發(fā)胃癌病例和723 100死亡病例，其中東亞地區(qū)(尤其是中國(guó)、韓國(guó)和日本)的胃癌發(fā)病率最高[1-2]。近年來(lái)，隨著早期診斷，個(gè)體化治療以及護(hù)理工作等各方面的提高和發(fā)展，胃癌患者的療效有所提高，但其預(yù)后仍然欠佳。因此，積極探索有效的腫瘤標(biāo)記物，用來(lái)預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后，從而進(jìn)行有效的治療和延長(zhǎng)生存時(shí)間是及其必要的。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)作為腫瘤細(xì)胞的家族成員之一，具有強(qiáng)大的自我更新、異質(zhì)性以及分化等特性，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)[3-4]。干細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子之一的八聚體結(jié)合蛋白4(octamer-binding transcription factor 4, OCT4)已被視為CSC的生物標(biāo)記物，參與多種癌癥的發(fā)展，如肝癌、食管癌、卵巢癌等[5-7]。然而，關(guān)于循環(huán)中OCT4的表達(dá)水平在胃癌患者中的作用目前尚不明確。本研究旨在評(píng)估血漿OCT4 mRNA表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 連續(xù)納入2010年4月-2011年4月行手術(shù)治療的胃癌患者137例，男性75例，女性62例；年齡(65.67±11.56)歲(43～96歲)；腫瘤大小(3.15±1.24)cm(0.5～6.0 cm)；低、中、高病理分化的患者分別有20例(15%)、99例(72%)及18例(13%)；T1，T2，T3及T4期的患者分別有3例(2%)、13例(9%)、119例(87%)及2例(1%)；N0，N1，N2及N3期的患者分別有49例(36%)、31例(23%)、49例(36%)及8例(6%)；處于M0及M1期的患者分別有135例(99%)及2例(1%)；根據(jù)TNM分期，處于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ及Ⅳ期的患者分別有16例(12%)，60例(44%)，59例(43%)及2例(1%)；血漿中OCT4 mRNA表達(dá)水平的中位值為2.316(0.219～8.450)。

入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)過(guò)臨床、影像和病理評(píng)估診斷為胃癌；(2)年齡>18歲；(3)術(shù)前未接收任何新輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并惡性血液疾??；(2)合并嚴(yán)重感染或肝腎功能不全；(3)合并或有其他實(shí)體腫瘤史；(4)認(rèn)知功能障礙或研究者判斷難以定期隨訪的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者在入組前均簽署了知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本獲取和檢測(cè) 術(shù)前抽取外周血4 mL，利用Trizol Reagent (RNAiso Blood: 9112, 日本TaKaRa公司)抽提總RNA，利用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。采用PrimerScript Real-time reagent kit (日本TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄RNA，運(yùn)用SYBR Premix Ex TaqTMII (日本TaKaRa公司)定量分析OCT4 mRNA的表達(dá)。

1.2.2信息搜集和隨訪 記錄患者的基線期年齡、性別、病理分期、腫瘤大小、T分期、N分期、M分期以及TNM分期。病理分期分為：高、中和低分化，TNM分期參考第七版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)胃癌分期標(biāo)準(zhǔn)(AJCC)。T分期按照T1～T4分別賦值0～3；N分期按照N0～N3分別賦值0～3；M分期按照M0～M1分別賦值0～1；TNM分期按照Ⅰ～Ⅳ分別賦值0～3進(jìn)行分析。所有患者術(shù)后前半年每月隨訪1次，之后每3～6月隨訪1次，中位隨訪時(shí)間51月，最后隨訪日期為2016年12月?；颊呖傮w生存期(overall survival, OS)是指手術(shù)到患者由于任何原因死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1OCT4 mRNA的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián) 血漿中OCT4 mRNA的表達(dá)水平與腫瘤大小(R=0.351,P<0.001)成正相關(guān)。血漿中OCT4 mRNA的表達(dá)水平與患者其他臨床病理特征的關(guān)聯(lián)見(jiàn)表1。

表1 OCT4 mRNA的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)

數(shù)據(jù)采用相關(guān)系數(shù)R，P值和N表示；采用Spearman檢驗(yàn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析.

2.2OCT4 mRNA的表達(dá)水平與DFS和OS的關(guān)聯(lián) 根據(jù)循環(huán)中OCT4表達(dá)水平的中位值，將患者分為OCT4高表達(dá)和低表達(dá)患者。采用K-M曲線和Log-rank檢驗(yàn)分析血漿OCT4 mRNA的表達(dá)與胃癌患者DFS和OS的關(guān)聯(lián)。胃癌患者的DFS中位值和均值分別為48.0月(21.5～61.0月)和41.1月(3～79月)；OS中位值和均值分別為69.0月(27.5～75.0月)和51.8月(3～80月)(P=0.001)。血漿OCT4 mRNA高表達(dá)水平患者的DFS及OS均比低表達(dá)患者差(圖1)。

2.3OCT4 mRNA的表達(dá)水平與DFS關(guān)聯(lián)的分析 相對(duì)于血漿OCT4 mRNA低表達(dá)水平，其高表達(dá)水平在腫瘤大小>3 cm(P=0.006)、病理分期為高分化(P=0.019)、病理分期為中分化(P=0.016)及TNM分期為Ⅱ期的患者(P=0.09)中與更差的DFS相關(guān)(圖2)。

2.4OCT4 mRNA的表達(dá)水平與OS關(guān)聯(lián)的分析 血漿OCT4 mRNA高表達(dá)相比于低表達(dá)在腫瘤大小<3 cm(P=0.005)、腫瘤大小>3 cm(P<0.001)、病理分期為中分化(P<0.001)、TNM分期為Ⅱ期(P=0.001)及TNM分期為Ⅲ/Ⅳ期的患者(P=0.005)中與更差的OS相關(guān)(圖3)。

2.5DFS的影響因素分析 單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，血漿OCT4 mRNA高表達(dá)水平(P=0.002)與患者較差的DFS有關(guān)。進(jìn)一步采用多元Cox回歸模型分析胃癌患者DFS的預(yù)測(cè)因素，結(jié)果顯示，血漿OCT4 mRNA高表達(dá)水平(P=0.006)能獨(dú)立預(yù)測(cè)患者較差的DFS。其他臨床病理特征對(duì)DFS的預(yù)測(cè)作用詳見(jiàn)表2。

DFS：無(wú)病生存期； OS總體生存期. A:DFS; B:OS.圖1 OCT4 mRNA表達(dá)水平與DFS和OS的關(guān)聯(lián)Fig 1 The correlation of OCT4 mRNA expression with DFS and OS

2.6OS的影響因素分析 單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析血漿OCT4 mRNA表達(dá)水平以及臨床病理特征分別對(duì)胃癌患者DFS的影響，結(jié)果顯示，血漿OCT4 mRNA高表達(dá)水平(P<0.001)、低分化(P=0.001)、高的N分期(P=0.034)以及高的TNM分期(P=0.010)均與患者較差的OS有關(guān)。進(jìn)一步采用多元Cox回歸模型分析胃癌患者OS的預(yù)測(cè)因素，結(jié)果顯示，血漿OCT4 mRNA高表達(dá)水平(P<0.001)能獨(dú)立預(yù)測(cè)患者較差的OS。其他臨床病理特征對(duì)OS的預(yù)測(cè)作用詳見(jiàn)表3。

圖2 OCT4 mRNA表達(dá)水平與DFS關(guān)聯(lián)的亞組分析Fig 2 The correlation of OCT4 mRNA expression with DFS in subgroups

圖3 OCT4 mRNA表達(dá)水平與OS關(guān)聯(lián)的亞組分析Fig 3 The correlation of OCT4 mRNA expression with OS in subgroups

項(xiàng) 目單元Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型P值HR95% CI低高多元Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型P值HR95% CI低高OCT4 mRNA高表達(dá)0.0021.7951.2482.5810.006 1.764 1.179 2.640 年齡>60歲0.5870.9040.6301.2990.562 1.135 0.740 1.739 性別(男)0.5061.1290.7901.6140.839 0.956 0.618 1.478 腫瘤大小>3 cm0.3681.1810.8221.6960.572 1.133 0.735 1.744 病理分期(低分化)0.211 1.236 0.887 1.722 0.853 0.962 0.642 1.443 T分期(高)0.5101.1530.7541.7640.936 0.970 0.460 2.045 N分期(高)0.1411.1480.9551.3790.410 1.221 0.760 1.960 M分期(高)0.137 2.938 0.710 12.157 0.186 4.995 0.461 54.116 TNM分期(高)0.111 1.237 0.952 1.607 0.834 0.916 0.405 2.073

表3 OS的影響因素分析

3 討 論

胃癌作為全球常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。由于鄰近組織的侵襲和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致胃癌患者臨床進(jìn)展迅速以及預(yù)后較差[8]。因此，盡早發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的有效腫瘤標(biāo)記物，對(duì)進(jìn)行有效的治療和延長(zhǎng)生存時(shí)間均具有重要臨床意義。

OCT4作為Pit-Oct-Unc (POU)結(jié)構(gòu)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在維持干細(xì)胞的自我更新、異質(zhì)性以及分化等特性中扮演著重要的角色[9-10]。大量研究表明，上調(diào)的OCT4可通過(guò)調(diào)節(jié)微小RNA(mircoRNA, miR)-26b/核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α2軸來(lái)促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[7]；通過(guò)調(diào)節(jié)miR-125b/BRI1相關(guān)受體激酶1信號(hào)通路來(lái)刺激宮頸癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡[11]；通過(guò)調(diào)節(jié)磷酸酶基因和細(xì)胞黏合素來(lái)增加肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12]；通過(guò)調(diào)節(jié)絲蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷徙[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，血漿OCT4 mRNA的表達(dá)水平與低分化以及腫瘤大小成正相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-15]。此外，比起血漿OCT4 mRNA低表達(dá)患者，高表達(dá)患者有較差的OS。這可能是因?yàn)镺CT4的表達(dá)水平可通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路和細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖遷徙和抑制其凋亡，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7, 11-12]。

此外，一些研究還評(píng)估了OCT4與惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系，其中，腫瘤組織中OCT4的高表達(dá)水平可作為食管癌、口腔癌以及膀胱癌等患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16-18]。盡管上述研究以腫瘤組織OCT4的表達(dá)為主，然而相對(duì)于腫瘤組織樣本，血液樣本的易獲得性及無(wú)創(chuàng)傷性使患者更易接受。因此，本研究分析了血漿OCT4 mRNA的表達(dá)水平對(duì)于胃癌患者的預(yù)后作用，結(jié)果顯示，血漿OCT4 mRNA的高表達(dá)與胃癌患者較短的OS相關(guān)，且可獨(dú)立預(yù)測(cè)其不好的預(yù)后，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-18]。原因可能是OCT4作為CSC的生物標(biāo)記物，其高表達(dá)可直接反映大量的CSC以及CSC更強(qiáng)的干性，這些干性可增加癌癥患者對(duì)放療、化療以及傳統(tǒng)的系統(tǒng)治療的耐藥性，從而降低治療效果，增加胃癌患者的復(fù)發(fā)率。因此OCT4與患者較差的預(yù)后相關(guān)[19-20]。此外，OCT4的表達(dá)水平可通過(guò)調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，如p38絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶/天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶、Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及絲蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路，來(lái)刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和遷徙，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，增加癌癥的復(fù)發(fā)率[10, 21-22]。

本研究尚有一些不足：(1)本研究主要納入處于TNM Ⅰ～Ⅲ期的胃癌患者，Ⅳ期患者僅2例，因此，血漿OCT4 mRNA的表達(dá)水平在Ⅳ期胃癌患者的預(yù)后作用尚不明確；(2)本研究樣本量相對(duì)較小，可能導(dǎo)致其統(tǒng)計(jì)效能降低，檢測(cè)指標(biāo)的95%CI增寬，有可能導(dǎo)致偏倚等。(3)本研究納入患者時(shí)并未限制患者的分期，導(dǎo)致研究對(duì)象的代表性不夠。

綜上所述，血漿OCT4 mRNA的表達(dá)水平可作為新穎的可靠的生物標(biāo)記物，用于評(píng)估胃癌患者的臨床病理特征和預(yù)后情況。