轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs對(duì)放射性肺損傷組織中細(xì)胞因子的影響

張春陽(yáng)，祝 艷，馮華松

目前針對(duì)放射性肺損傷(RILI)，仍缺少有效的治療手段。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有減輕放射性肺損傷、肺纖維化的作用[1]，且目前已開(kāi)展臨床試驗(yàn)研究探索[2]，但具體的作用機(jī)制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)提高M(jìn)SCs上CXCR4基因的表達(dá)后，可增強(qiáng)其向受損傷組織部位的歸巢，提升治療效果[3]。前期研究中[4]，筆者已證實(shí)通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，使來(lái)源于臍帶的MSCs過(guò)表達(dá)CXCR4基因后，MSCs的趨化、遷移能力提高。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于病毒轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs對(duì)RILI中細(xì)胞因子影響的報(bào)道。本研究通過(guò)觀察慢病毒轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs對(duì)參與放射性肺損傷的10 kDa干擾素γ誘導(dǎo)蛋白（IP-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1（TGF-β1）、血小板源生長(zhǎng)因子 (PDGF)、腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）-2的影響，探討轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs治療RILI可能的機(jī)制，為MSCs在臨床中的應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源與準(zhǔn)備 新生兒臍帶來(lái)源于醫(yī)院婦產(chǎn)科，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，與產(chǎn)婦及家屬簽署知情同意書(shū)后，無(wú)菌條件下留取剖宮產(chǎn)的足月健康新生兒臍帶，經(jīng)組織塊法貼壁培養(yǎng)[5]，實(shí)驗(yàn)采用第3代細(xì)胞。MSCs已進(jìn)行多向分化和免疫表型鑒定[5]。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染第3代MSCs，治療組細(xì)胞采用攜帶 CXCR4和 EGFP的慢病毒載體（LV-CXCR4-EGFP），對(duì)照組細(xì)胞采用僅攜帶EGFP的慢病毒載體（LV-EGFP）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[4]。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 CXCR4基因設(shè)定來(lái)源于人類(lèi)，GENE ID為 7852，Genebank編號(hào)為 NM_001008540。CXCR4慢病毒載體，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司協(xié)助構(gòu)建，載體為GV287，分子量為 10.4 kb，元件順序?yàn)椋篣bi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位點(diǎn)為AgeI/AgeI。C57雌性小鼠，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素（Hyclone公司，美國(guó)），胰蛋白酶（Trypsin）（Invitrogen 公司，美國(guó)），胎牛血清(FBS)（Gibco 公司，美國(guó)），羥脯胺酸（HYP）、丙二醛（MDA）ELISA試劑盒（華美生物有限公司），PDGF、TGF-β1 ELISA 試劑盒（Abcam 公司，美國(guó)），TNF-α ELISA試劑盒（Abcam公司，美國(guó)）。熒光倒置顯微 鏡 （Olympus 公司，CKX-41，日本），酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建放射性肺損傷小鼠模型 將24只雌性出生后2個(gè)月左右的C57小鼠，隨機(jī)分為4組：正常組、照射組、對(duì)照組和治療組，每組各6只。照射組、對(duì)照組和治療組小鼠腹腔注射5%水合氯醛（每只0.006 ml/g）麻醉后，呈俯臥位固定鼠板上。調(diào)整直線(xiàn)加速器照射野，設(shè)定照射參數(shù)(13 Gy，6 MV，3.68 Gy/min)，窗寬 20 cm×2.5 cm，源距 1 m，給予全肺一次性X線(xiàn)照射。照射之后，將小鼠放置動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.2 各組干預(yù)措施 對(duì)照組和治療組于放射線(xiàn)照射后第1 d，分別自小鼠尾靜脈注射LV-EGFP和LV-CXCR4-EGFP轉(zhuǎn)染后的MSCs，每只細(xì)胞數(shù)量5×105/0.2 ml。正常組和照射組，分別經(jīng)尾靜脈注射約0.2 ml的0.9%生理鹽水。

1.3 熒光顯微鏡觀察 放射線(xiàn)照射后的第7 d，處死小鼠后留取肺組織檢測(cè)。取小鼠右肺下葉肺組織標(biāo)本，進(jìn)行冰凍切片，厚度5 μm；用含DAPI的甘油封片劑封片，熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP標(biāo)記的MSCs在肺組織的分布情況。

1.4 病理組織學(xué)觀察 左肺下葉標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片，厚5 μm，行HE染色，光鏡下觀察病理組織學(xué)的變化。

1.5 ELISA檢測(cè) 取小鼠右肺上葉標(biāo)本，組織勻漿后，采用相應(yīng)的ELISA試劑盒檢測(cè)HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和 MMP-2 的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs在肺組織中分布 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和治療組肺組織內(nèi)有綠色熒光表達(dá)的細(xì)胞，且治療組表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組；而照射組肺組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的綠色熒光表達(dá)（圖1）。

圖1 熒光顯微鏡檢測(cè)小鼠肺組織內(nèi)EGFP標(biāo)記的MSCs分布

2.2 病理組織學(xué)觀察 HE染色可見(jiàn)，正常組肺組織肺泡壁完整，肺間質(zhì)無(wú)增厚，無(wú)明顯的炎性細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)組織清晰（圖2a）；照射組肺組織可見(jiàn)肺泡間隔增厚，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔逐漸變小，部分萎陷，肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞（圖2b）；治療組和對(duì)照組肺組織內(nèi)，亦可見(jiàn)局部肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但肺泡間隔增厚程度明顯較照射組減輕，肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞也較照射組明顯減輕（圖 2c、d）。

圖2 小鼠肺組織病理組織學(xué)HE染色

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果 與正常組比較，照射組肺組 織 內(nèi) HYP、MDA、IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α 和MMP-2表達(dá)明顯升高（P＜0.01），而治療組和對(duì)照組較照射組明顯下降（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，除TNF外，治療組其他指標(biāo)下降的更加明顯（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，治療組肺組織內(nèi)EGFP標(biāo)記的MSCs數(shù)量比對(duì)照組增多，提示轉(zhuǎn)染CXCR4后MSCs歸巢能力提高，與前期體外研究的結(jié)果相符合[4]。同時(shí)，組織病理學(xué)結(jié)果和反映組織氧化應(yīng)激損傷的MDA和纖維化程度的HYP含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs較對(duì)照組MSCs，更明顯地減輕放射線(xiàn)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并減少HYP的升高，提示其具有更好的減輕RILI作用。

RILI發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，涉及多種細(xì)胞因子和靶細(xì)胞相互作用，有促進(jìn)和修復(fù)作用的細(xì)胞因子是影響 RILI發(fā)展趨勢(shì)的主要因素[6]。IP-10、TGF-β1、PDGF、TNF-α和MMPs被認(rèn)為具有參與損傷、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)纖維化形成的作用[6]。IP-10是屬于CXC趨化因子家族的促炎細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)不同的細(xì)胞系中起到誘導(dǎo)趨化性作用[7]，被認(rèn)為參與介導(dǎo)RILI免疫反應(yīng)[6]。TGF-β1是致纖維化細(xì)胞因子，被認(rèn)為是放射性肺損傷重要的標(biāo)志物之一[8]，給予輸注MSCs后，可降低RILI小鼠體內(nèi)TGF-β1的水平[9]。PDGF具有趨化炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的作用，使肺內(nèi)成纖維細(xì)胞分裂和增殖增加，促進(jìn)纖維化的形成[10]。TNF-α是促炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子[10]，在RILI的發(fā)生和維持過(guò)程中具有重要作用。MSCs通過(guò)拮抗TNF-α阻斷纖維化信號(hào)通路[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，肺纖維化早期階段，MMPs的水平升高，降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用增強(qiáng)，從而損傷肺組織。本研究發(fā)現(xiàn)，上述細(xì)胞因子在放射線(xiàn)照射后小鼠肺組織內(nèi)表達(dá)均明顯升高，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。而在給予MSCs后，其表達(dá)水平均顯著下降，其中轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs相對(duì)于對(duì)照組，其抑制作用更加明顯，提示轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs具有更好的抑制放射線(xiàn)照射致細(xì)胞因子異常表達(dá)作用，從而減輕RILI。這有可能與提升MSCs趨化歸巢能力后，使進(jìn)入局部損傷組織的MSCs增多有關(guān)，但不能排除局部由于過(guò)表達(dá)CXCR4后，影響了RILI組織內(nèi)其他的信號(hào)通路機(jī)制導(dǎo)致有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究明確。

表1 各組ELISA檢測(cè)結(jié)果比較(n=6)

綜上所述，通過(guò)輸注轉(zhuǎn)染CXCR4的MSCs可更好地減輕RILI，更有效地抑制參與RILI細(xì)胞因子的異常升高，為今后利用基因修飾的MSCs治療RILI提供有力的理論依據(jù)。