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    扶正解毒通絡(luò)方對人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制研究①

    2018-10-26 07:33:24趙忠偉張景洲
    中國免疫學(xué)雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:含藥扶正通絡(luò)

    趙忠偉 曲 寧 楊 明 張景洲

    (長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,長春130021)

    經(jīng)臨床研究表明,肝細(xì)胞癌的死亡率和發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升的趨勢,且其死亡率和發(fā)病率在各種惡性腫瘤中仍居高不下,各國人民受其影響很大。“毒損肝絡(luò)”的基本理論認(rèn)為是毒邪作祟、阻滯于肝絡(luò),出現(xiàn)絡(luò)虛、毒侵,而化毒為害是絡(luò)病遷延和深化的關(guān)鍵所在。基于以上理論,根據(jù)本科室多年臨床經(jīng)驗擬方扶正解毒通絡(luò)方,選用姜黃、當(dāng)歸、黃芪、桂枝等中藥,使血和氣行、血絡(luò)通暢。肝絡(luò)通達(dá),則絡(luò)虛可補(bǔ),毒瘀可祛,從而達(dá)到扶正解毒通絡(luò)的治療目的。目前對于肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病機(jī)制的說法很多,針對其發(fā)病機(jī)制有著大量的研究,但可以確定的是,肝細(xì)胞癌無論是在體外培養(yǎng)的還是在體內(nèi)存在的,都存在著一種現(xiàn)象即細(xì)胞凋亡,其凋亡的程度與快速退化組織中的凋亡相類似。本文通過制備大鼠血清,觀察扶正解毒通絡(luò)方低劑量、中劑量、高劑量含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞增殖情況的影響,對HepG2人肝癌細(xì)胞早期凋亡情況的影響,對HepG2人肝癌細(xì)胞內(nèi)Bax及Bcl-2 mRNA水平的影響,對細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平的影響。以探討扶正解毒通絡(luò)方對HepG2人肝癌細(xì)胞的作用及機(jī)制,為中醫(yī)藥治療HCC提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實驗材料、試劑 MTT購于美國Sigma公司;試劑Bax、Bcl-2購于美國CST公司;Caspase-3購于英國Abcam公司;SIRT3購于香港Abcam有限公司;Fas購于美國SANTA CRUI公司;P53購于上海賽信通生物試劑有限公司。

    1.2實驗方法

    1.2.1扶正解毒通絡(luò)方灌胃溶液的制備 扶正解毒通絡(luò)方由姜黃20 g、黃芪10 g、當(dāng)歸9 g、桂枝10 g組成。將藥物水煎3次,然后合并濃縮至含生藥0.4 g/ml濃度。

    1.2.2扶正解毒通絡(luò)方含藥血清的制備 SD大鼠雄性24只,隨機(jī)分成空白組、扶正解毒通絡(luò)方低劑量、中劑量、高劑量共4組,每組6只??瞻捉M給予蒸餾水1 ml/100 g灌胃,低劑量組、中劑量組、高劑量組給予扶正解毒通絡(luò)方1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg灌胃,連續(xù)5 d,每日2次,于第4天結(jié)束后禁食禁水,第5天給藥結(jié)束后,將大鼠麻醉(0.3 ml/100 g水合氯醛),然后進(jìn)行腹主動脈取血。靜置4 h(室溫),取其上清血。與同組動物血清相融合,56℃加熱30 min,即可成功滅活,將其用0.22 μm微孔濾膜于無菌環(huán)境中進(jìn)行過濾除菌及分裝,置于-20℃的冰箱中保存。

    1.2.3HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 待細(xì)胞在培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中達(dá)到指數(shù)生長期時,消化法(0.25%胰蛋白酶-EDTA)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。PBS吸除剩余培養(yǎng)液置于37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,鏡下觀察,盡快滴入培養(yǎng)液(含血清),1 000×g離心5 min,取上清,重懸計數(shù),置于新培養(yǎng)瓶以3×105~5×105cells/ml細(xì)胞數(shù)接種,置于培養(yǎng)箱,運用上述培養(yǎng)條件培養(yǎng),2~3 d 進(jìn)行一次傳代。

    1.2.4細(xì)胞活力檢測 采用MTT法檢測細(xì)胞活力,取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液密度為4.5×104~5×104cells/ml范圍內(nèi),在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種100 μl,實驗分為正常血清組、正常對照組、扶正解毒通絡(luò)方低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組和陽性對照組(順鉑)共6組,每組6孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d(37℃,5%CO2),正常對照組加入培養(yǎng)液100 μl、正常血清組加入大鼠血清培養(yǎng)液100 μl,扶正解毒通絡(luò)方低、中、高含藥血清組分別加入其對應(yīng)的含藥大鼠血清培養(yǎng)液100 μl,陽性對照組加入順鉑溶液(10 μg/ml)100 μl。并將等量的含血清培養(yǎng)液滴入到設(shè)定的6個平行孔中,其平行孔全部設(shè)為調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)(24 h),加入MTT(20 μl,5 mg/ml),分別置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h(37℃,5%CO2)棄培養(yǎng)液,每孔加入150 μl DMSO,酶標(biāo)分析儀速度調(diào)至中速、波長570 nm,振蕩5 min,測定6孔中的OD值,計算各組不同濃度含藥血清的抑制率[1]。

    1.2.5RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2 mRNA水平 采用Trizol提取腫瘤細(xì)胞RNA,將Trizol 1~2 ml 加入到60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中靜置3 min,取上清液置1.5 ml EP管中;2 000×g離心5 min,去沉淀;加入200 μl氯仿,震蕩15 min,混勻,靜置15 min;4℃下12 000×g離心15 min,4℃下加入0.5 ml 異丙醇,室溫靜置10 min;4℃ 12 000×g離心10 min,去上清液,RNA沉于管底;加入75%的乙醇,輕震蕩,沉淀;4℃下8 000×g離心5 min,去上清液,干燥10 min(室溫);每管用被DEPC(50 μl)處理過的水溶解RNA,10 min(55~60℃);測定A260和A280處的OD值,判斷RNA的純度并定量;將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;熒光實時定量PCR。

    1.2.6免疫印跡(Western blot)檢測細(xì)胞中Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平 提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗與靶蛋白結(jié)合,酶標(biāo)記的二抗和一抗結(jié)合,顯色。

    2 結(jié)果

    2.1扶正解毒通絡(luò)方含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞增殖的影響 與正常對照組比較,正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖無影響,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與正常血清組比較,扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組都能顯著抑制肝癌細(xì)胞的過度增殖,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

    2.2含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA水平的影響 與正常對照組比較,正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2胞內(nèi)Bcl-2和Bax mRNA水平無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與正常血清組比較,扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2胞內(nèi)Bc1-2基因轉(zhuǎn)錄減少,Bax基因轉(zhuǎn)錄增加,見圖2、3。

    2.3含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平的影響與正常對照組比較,正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表達(dá)水平無明顯改變;與正常血清組比較,扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)減少,Bax、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表達(dá)增加(圖4)。

    圖1 含藥血清對肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of medicated serum on proliferation of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,*.P<0.05,**.P<0.01.

    圖2 含藥血清對肝癌細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平的影響Fig.2 Effect of medicated serum on level of Bcl-2 mRNA of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,**.P<0.01.

    圖3 含藥血清對肝癌細(xì)胞Bax水平的影響Fig.3 Effect of medicated serum on level of Bax of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,**.P<0.01.

    圖4 蛋白Western blot結(jié)果Fig.4 Protein Western blot resultsNote: 1.Normal control group;2.Normal serum group;3.Low dose group;4.Middle dose group;5.High dose group;6.Positive control group.

    3 討論

    臨床的惡性腫瘤中,HCC是非常常見的惡性腫瘤之一,與人類所處的生存環(huán)境不斷被污染和破壞有關(guān),而且這種趨勢越來越明顯的加重,最終導(dǎo)致了大量癌癥特別是肝癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前為止,醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為手術(shù)切除仍然是治愈早期肝癌的最理想方法,然而,即使是對患者腫物進(jìn)行根治性切除,60%以上的HCC患者在術(shù)后5年內(nèi)仍將會發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。盡管目前對于HCC患者來說,腫瘤分化程度、腫瘤大小、是否存在血管侵襲等臨床因素與HCC患者治療方案的選擇及預(yù)后關(guān)系密切,但是HCC的發(fā)病機(jī)制目前仍不是十分清楚,因此,探討HCC的發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)因素,尋找肝癌早期診斷、早期治療的方法和途徑,是目前肝細(xì)胞癌研究過程中的重要任務(wù)之一。

    根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病學(xué)理論,我們提出了“毒損肝絡(luò)”學(xué)說,用于治療肝細(xì)胞癌,我們認(rèn)為毒邪作祟、最終阻滯于肝絡(luò),出現(xiàn)絡(luò)虛、毒侵,而瘀毒成為致病因素,成為絡(luò)病遷延不愈和疾病不斷深化的病機(jī)關(guān)鍵。其中,毒邪是HCC的啟動因子,即“邪毒”造成“肝絡(luò)之損”,最終又導(dǎo)致“肝絡(luò)之變”;“瘀”是重要的樞紐因子,是這些慢性肝病發(fā)病甚至癌變的中心環(huán)節(jié),也是“肝炎發(fā)展為肝硬化甚至變?yōu)楦伟标P(guān)鍵所在[2]。所以治療原則上以通絡(luò)為基礎(chǔ),兼以扶正解毒,故選用姜黃、黃芪、當(dāng)歸、桂枝等中藥,使血和氣行,血絡(luò)通暢。肝絡(luò)疏通調(diào)暢,則絡(luò)虛得補(bǔ),瘀毒得祛,達(dá)到通絡(luò)治療的目的。中藥具有的療效很多,例如祛邪扶正、補(bǔ)益元氣等,且研究表明,中藥在抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時不會對其他正常細(xì)胞有所損傷。扶正解毒通絡(luò)方是以中醫(yī)學(xué)“毒損肝絡(luò)”理論為基礎(chǔ),根據(jù)多年臨床經(jīng)驗?zāi)毘龅目垢伟灧?,既往的臨床研究表明,扶正解毒通絡(luò)方可具有延長患者生存期,提高患者生存質(zhì)量的功效。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡、壞死是抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖的重要方式,其中凋亡是一種細(xì)胞死亡的正常方式,其具有一定的程序性特點,是機(jī)體清除異常分化細(xì)胞或衰老細(xì)胞的重要方法[3]。中藥復(fù)方扶正解毒通絡(luò)方的前期臨床研究表明,該方在肝細(xì)胞癌的治療中能夠改善患者的臨床癥狀,延長腫瘤患者的生存期,提高患者生存質(zhì)量,降低患者肝功中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等,一定程度上提高機(jī)體的免疫力,可有效抑制腫瘤的生長。

    死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是正常細(xì)胞在凋亡調(diào)控過程中依賴的三個進(jìn)化保守的信號傳導(dǎo)途徑。凋亡的發(fā)生是由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng),即caspase在凋亡誘導(dǎo)信號的作用下,啟動型caspase先激活,從而發(fā)揮水解酶的活性,激活下游的效應(yīng)型caspase,一旦效應(yīng)型caspase被激活,就可以大范圍的水解細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì),從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白,使細(xì)胞不可逆地走向死亡。細(xì)胞的凋亡分為凋亡誘導(dǎo)、調(diào)控執(zhí)行和效應(yīng)三個階段,最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者是caspase-3[4]。Bcl-2和Bax通過調(diào)控線粒體膜的通透性從而控制細(xì)胞色素C的釋放,達(dá)到調(diào)控下游caspase-3蛋白酶活化的目的,介導(dǎo)細(xì)胞的存活或者死亡[5]。本實驗研究表明,與正常對照組比較,正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、活化的caspase-3基因及蛋白表達(dá)水平無明顯改變;與正常血清組比較,扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2胞內(nèi)Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄減少,蛋白表達(dá)減少;Bax基因轉(zhuǎn)錄增加,蛋白表達(dá)增加;活化的caspase-3蛋白表達(dá)增加。

    Fas是細(xì)胞凋亡的重要信號分子,能夠和FasL或Fas抗體結(jié)合,觸發(fā)Fas所在靶細(xì)胞在短時間內(nèi)發(fā)生凋亡[6]。在Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中,caspase起關(guān)鍵性作用,caspase-3首先被激活,然后激活caspase-6,7,最終導(dǎo)致多種死亡底物的降解,完成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程[7];沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)是Sirtuins家族中的成員;P53在腫瘤生長抑制過程中也發(fā)揮了重要的作用。

    本實驗結(jié)果顯示,與正常血清組比較,扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)減少,Bax、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表達(dá)增加。因此,我們推測扶正解毒通絡(luò)方通過上調(diào)SIRT3的表達(dá),激活Fas,進(jìn)而誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)錄增加,增加Bcl-2/Bax比值,啟動caspase途徑,誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡水平上升[8,9]。同時,SIRT3的增加還可以誘導(dǎo)P53表達(dá)的增加,繼續(xù)誘導(dǎo)Bax基因表達(dá)增加[10],最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[11,12]。

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