鄰香草醛縮5-氨基水楊酸釹配合物對S.Pombe生長代謝的影響研究

蔣建宏，鄒柔，周杰，黎泰玲，于夢粵，瞿沙，何小鳳，鄧斌*

(1.湘南稀貴金屬化合物及其應(yīng)用湖南省重點實驗室，湖南 郴州 423043；2.湘南學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 郴州 423043)

鄰香草醛本身具有抗菌活性，能夠治療和預(yù)防疾病，而水楊醛類Schiff堿配合物更是具有良好的抗癌、抗炎作用，使得該類配合物在近年掀起一陣研究熱潮.長期一直被作為臨床藥物廣泛使用的5-氨基水楊酸具有殺菌消炎、解熱止痛等多種醫(yī)學(xué)作用[1-2].從配位化學(xué)的角度，5-氨基水楊酸與鄰香草醛合成的Schiff堿含有多個強電負性的氮、氧配位原子，致使其配位能力極強并且能夠形成各式各樣的配位方式，能夠以金屬離子作為中心原子鍵合形成穩(wěn)定的配合物，具有一定的意義.此外，稀土元素與有機分子形成配合物現(xiàn)已被證實具有抗菌、抗腫瘤和抗病毒[3-4]等生物活性，并有研究證明配體的生物活性在形成配合物以后會增強到不同的程度且毒性減弱[5].現(xiàn)今已有多種自由基抑制劑、催化劑和氧載體都是由稀土Schiff堿配合物制得[6].故此類配合物的合成不論是對配位化學(xué)還是醫(yī)學(xué)研究上尋找高效低毒的藥物，都體現(xiàn)出不可小覷的意義.

有關(guān)鄰香草醛縮5-氨基水楊酸釹配合物的研究中，已有文獻合成并表征了其結(jié)構(gòu)[7]，但其抗菌作用至今未見報道.在微生物耐藥性蔓延的今天，研究配合物的抗菌活性，可為抗菌類藥物的研發(fā)和篩選提供一定的參考價值.粟酒裂殖酵母細胞(S.Pombe)的生長周期與高等動物真核細胞非常類似，以它為研究對象做與真核細胞生物相關(guān)的研究探索是個絕佳的選擇[8].鑒于此，本文參照文獻[7]合成鄰香草醛縮5-氨基水楊酸釹配合物，并利用生物微量熱法探討其對S.Pombe生長的影響.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

Avatar360型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；2400 Series II CHNS/O元素分析儀(美國PerkinElmer公司)；3116-2/3239TAM Air八通道熱導(dǎo)式等溫微量熱儀(瑞典Thermometric AB公司).

鄰香草醛(百順(北京)化學(xué)科技有限公司，AR)；5-氨基水楊酸(安徽酷爾生物工程有限公司，AR)；無水乙醇(長沙有機試劑廠，AR)；六水合氯化釹(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，AR).

粟酒裂殖酵母細胞(S.Pombe)，由西班牙薩拉曼卡大學(xué)(University of Salamanca)Faustino Mollinedo教授惠贈.

1.2 培養(yǎng)基

YES培養(yǎng)基，成分如下：酵母粉10.0000 g，葡萄糖60.0000 g，L-Leu 0.4500 g，L-Lys 0.4500 g，L-His 0.4500 g，尿嘧啶0.4500 g，腺嘌呤0.4500 g，均勻溶解于2 L三重蒸餾水中，分裝于三角瓶后用牛皮紙密封，在121 ℃下進行高壓滅菌20 min備用.

1.3 Schiff堿及其配合物的制備

1.3.1 鄰香草醛5-氨基水楊酸Schiff堿的制備

稱取10 mmol(1.531 g)5-氨基水楊酸，充分溶解于30 mL無水乙醇，然后逐滴加入10 mmol(1.521 g)鄰香草醛的無水乙醇溶液.在室溫下避光攪拌3 h生成桔紅色沉淀.過濾后將沉淀用無水乙醇進行重結(jié)晶，真空干燥，得到紅色固體.

1.3.2 鄰香草醛縮5-氨基水楊酸釹配合物的制備

稱取3 mmol(0.862 g)新制鄰香草醛5-氨基水楊酸Schiff堿配體，加熱回流使其溶解在60 mL無水乙醇中，然后逐滴加入10 mL含1 mmol六水合氯化釹的無水乙醇溶液，立即產(chǎn)生桔黃色沉淀，80 ℃下回流攪拌3 h后，冷卻，過濾，用無水乙醇洗滌產(chǎn)物直至洗滌液體無Cl-，真空干燥至恒重.

1.3.3 紅外光譜

圖1 鄰香草醛、5-氨基水楊酸、配體及其釹配合物紅外光譜圖Fig.1 IR spectra of O-vanillin，5-aminosalicylic acid，ligand and its neodymium complex

將樣品研細后取約2 mg，與100～200 mg干燥KBr粉末充分研磨均勻，取適量使之在模具中均勻分布，壓成光滑的透明薄片.在KBr的參比下對藥品進行紅外光線掃描.分別測鄰香草醛、5-氨基水楊酸、鄰香草醛縮5-氨基水楊酸Schiff堿及其釹配合物的在波數(shù)為4000-500 cm-1段的紅外光譜，如圖1所示，所得紅外圖譜與文獻[7]相符.

1.4 配合物對S.Pombe的影響

實驗方法和操作步驟依據(jù)文獻[9]，采用TAM Air熱導(dǎo)式等溫微量熱儀實時監(jiān)測配合物作用下S.Pombe生長代謝的熱功率.

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜

將采用KBr壓片法測得的四種樣品在4000-500 cm-1波數(shù)段的紅外吸收光譜圖整合如圖1所示.

2.2 元素分析

配合物的C、H、N含量由元素分析儀測得，配合物中的釹含量用EDTA法滴定得出.結(jié)果如表1所示，實測值與理論值基本相符.

表1 配合物的元素分析測定結(jié)果

2.3 配合物對S.Pombe作用的熱動力學(xué)研究

2.3.1 S.Pombe的生產(chǎn)熱功率曲線

在305.15 K的條件下，分別接種106cell/mLS.Pombe于8個含有5 mL培養(yǎng)基的安瓿瓶中，再依次加入濃度遞增的配合物溶液，測得在各濃度配合物影響下的S.Pombe生產(chǎn)熱功率曲線如圖2(a)所示.

圖2(a) 在配合物作用下S.Pombe的生產(chǎn)熱功率曲線Fig.2(a) Thermal power curves of S.Pombe under different concentrations complex

圖2(b) 無配合物作用下S.Pombe的生產(chǎn)熱功率曲線Fig.2(b) Thermal power curve of S.Pombe without complex

a，0 g/L；b，0.0505 g/L；c，0.0673 g/L；d，0.0841 g/L；e，0.1009 g/L；f；0.1177 g/L；g，0.1346 g/L；h，0.1514 g/L；

2.3.2 S.Pombe的生長速率常數(shù)k和傳代時間tG

分析圖2(b)中無配合物作用下細胞生產(chǎn)熱功率曲線可以得出，S.Pombe的生長期呈現(xiàn)出固定的規(guī)律.其在一段短期的生長停滯之后生長速率大幅度增加，直至達到生產(chǎn)熱功率的最高點.S.Pombe大幅度生長階段稱為指數(shù)生長期(AB段)，這期間數(shù)量增長有如下表示

lnPt=lnP0-kt0+kt

(1)

令(t-t0)=tG，則nt/n0=2，即Pt/P0=2

將式(1)變形得：

ln(Pt/P0)=k(t-t0)

(2)

在(2)式中，Pt表示S.Pombe在t時刻的熱釋放功率；k表示S.Pombe在指數(shù)生長期的生長速率常數(shù)；用計算機將指數(shù)生長期所對應(yīng)的曲線線段進行直線擬合，即可得到在不同配合物濃度作用下S.Pombe的生長速率常數(shù)k，S.Pombe在不同配合物濃度作用下的傳代時間tG(見表2)由公式tG=(ln2)/k計算得到.

2.3.3 S.Pombe的抑制率I和半抑制濃度CI，50

配合物對細胞成長的抑制率有如下表示：

I=(K0-Kc)/K0×100 %

(3)

(3)式的K0表示S.Pombe正常生長狀態(tài)下的生長速率常數(shù)，Kc表示S.Pombe在配合物濃度為c時所對應(yīng)的生長速率常數(shù).當抑制率達到50 %時所對應(yīng)的配合物濃度叫做半抑制濃度CI，50.將各配合物濃度下的生長速率常數(shù)依次代入公式(3)則可計算得到S.Pombe在不同濃度配合物作用下的抑制率I.將抑制率I與配合物濃度進行Logistic擬合得到曲線方程，令抑制率等于50 %即可算出抑制濃度CI，50(見表2).半抑制濃度直接反映配合物的抗菌活性，抗菌活性越強，對S.Pombe的生長抑制效果越好，配合物的半抑制濃度CI，50越小.鄰香草醛縮5-氨基水楊酸釹配合物對S.Pombe的半抑制濃度為0.1314 g/L.

表2 305.15 K時，S.Pombe在不同配合物濃度作用下生長期的熱動力學(xué)參數(shù)

c(g/L)，配合物濃度；k(s-1)，生長速率常數(shù)；I(%)，抑制率；tmax(s)，達到最大發(fā)熱功率所需時間；tG(s)，傳代時間；R，線性匹配相關(guān)系數(shù).

c(g/L)，The concentrations of complex；k(s-1)，Growth rate constant；I(%)，Inhibition ratio；tmax(s)，Maximum heating power time；tG(s)，The generation time；R，The linear matching coefficient.

2.3.4 生長速率常數(shù)k與濃度c的關(guān)系

由公式(2)可知，生長速率常數(shù)k與熱輸出功率的自然對數(shù)ln(Pt/P0)成正比，即S.Pombe在指數(shù)生長期的產(chǎn)熱功率越大，k值就越大.經(jīng)過分析得出S.Pombe在上述不同配合物濃度下的生長速率常數(shù)k后，作出點狀圖并進行Logistic曲線擬合，如圖3所示，可直觀看出，隨著配合物的濃度逐漸增大，生長速率常數(shù)k值呈下降趨勢，即說明配合物的存在抑制了S.Pombe的生長.

由圖3可得到曲線方程：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相關(guān)系數(shù)R=0.9824

2.3.5 抑制率I與濃度c的關(guān)系

將配合物對S.Pombe生長的抑制率I與相應(yīng)濃度c的點狀圖進行Logistic曲線擬合得到圖4.從圖中可以看出，隨著配合物濃度的增加，配合物對S.Pombe的抑制率呈上升趨勢，說明配合物抑制作用的強度隨著濃度的增大而增大.

圖3 S.Pombe的生長速率常數(shù)k與配合物濃度c的關(guān)系Fig.3 Growth rate constant(k)of S.pombe with different concentrations of complex

圖4 配合物對S.Pombe的抑制率I與配合物濃度c的關(guān)系Fig.4 Inhibition ratio(I)of S.pombe with different concentrations of complex

由圖4可得直線方程：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相關(guān)系數(shù)R=0.9824

2.3.6 傳代時間tG與濃度c的關(guān)系

將S.Pombe的傳代時間tG與配合物濃度c的點狀圖進行Logistic曲線擬合得到圖5.由圖5可知，當配合物濃度的逐漸變大時，S.Pombe所需要的傳代時間tG越長，表明配合物使得S.Pombe的生長速度變得緩慢，而且濃度越大，傳代所需時間越長.

由圖5可得到曲線方程為：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相關(guān)系數(shù)R=0.9760

2.3.7 達到生長代謝最大功率所需時間tmax與濃度c的關(guān)系

將S.Pombe的生長達到頂峰也就是生長熱曲線的頂點所需的時間tmax與配合物濃度c的點狀圖進行Logistic曲線擬合，如圖6所示關(guān)系.由圖6可知，隨著配合物濃度的增加，S.Pombe達到生長代謝最大功率所需的時間tmax越長，同樣說明其生長速度在逐漸變得緩慢.

圖5 S.Pombe傳代時間tG與配合物濃度c的關(guān)系Fig.5 The generation time(tG)of S.pombe with different concentrations of complex

圖6 達到S.Pombe生長代謝最大功率所需時間tmax與配合物濃度c的關(guān)系Fig.6 Maximum heating power time(tmax)of S.pombe with different concentrations of complex

由圖6可得到曲線方程為：

[0≤c(配合物)≤0.1514 g/L]；相關(guān)系數(shù)R=0.9977

3 結(jié) 論

本實驗依照原有文獻合成了鄰香草醛縮5-氨基水楊酸釹配合物，運用TAM Air微量熱儀實時監(jiān)測得配合物在305.15 K時對S.Pombe生長代謝熱曲線，繼而分析了S.Pombe在不同配合物濃度作用下的多項熱動力學(xué)參數(shù).實驗結(jié)果表明：當配合物的濃度逐漸增加時，S.Pombe的生長代謝速率常數(shù)k漸漸縮小而達最大發(fā)熱功率的時間tmax、傳代時間tG和抑制率I都呈現(xiàn)增長趨勢，求解得到半抑制濃度CI，50為0.1341 g/L.實驗得出結(jié)論：配合物能夠抑制S.Pombe的生長，并且抑制程度正相關(guān)于配合物的量.其以何種方式對細胞的生長進行抑制還有待進一步探索研究.