正交試驗確定扇貝蛋白質(zhì)沉淀的最佳條件

王娜 張國庚

(河北農(nóng)業(yè)大學渤海校區(qū)，河北滄州 061100)

1 材料與方法

1.1 實驗原理

水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)提取可以利用氯化鈉在恒溫水浴鍋不同時間和溫度實現(xiàn)，用考馬斯亮藍G-250作為染料，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍色，波長595nm處測定光吸收值，光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。

1.2 實驗材料和試劑

(1)扇貝(河北滄州黃驊市海鮮市場)；

(2)蛋白質(zhì)標準溶液的配制[1]；

(3)考馬斯亮藍G-250試劑的配制[2]。

1.3 實驗儀器

721型可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；漏斗；濾紙；燒杯；玻璃棒；量筒；手動勻漿器，容量瓶。

1.4 實驗方法

a. 取三只小燒杯，各放入2g扇貝肉，調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋溫度85℃、90℃、95℃，用手動勻漿器攪碎貝肉，配制濃度分別為1%、5%、10%的氯化鈉溶液100mL于3個錐形瓶中，恒溫水浴鍋里分別煮30min、45min、60min，過濾后提取液定容到100mL。

以此類推，做L9正交試驗。

b. 蛋白質(zhì)含量的測定

c. 標準曲線的制作

取6支試管并編號，按下表1加入試劑，搖勻后靜置2min，595nm波長下比色測定。

表1 制作標準曲線所加試劑

d. 蛋白質(zhì)含量測定

加入樣品提取液0.1mL，考馬斯亮藍G-250試劑5mL，靜置2min，曲線1號試管作參比，595nm波長下比色，記錄光吸收值，比較樣品蛋白質(zhì)的含量[3]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

a. 蛋白質(zhì)標準曲線

以牛血清蛋白含量(μg)作為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制尺度曲線[4]。

圖1 蛋白質(zhì)的標準曲線

由圖1可得蛋白質(zhì)含量的曲線是y=0.0065x-0.0013，根據(jù)此方程便可得到正交試驗9個樣品蛋白質(zhì)的含量。

b. 確定正交試驗分析最佳條件

影響蛋白質(zhì)沉淀的因素很多，如溫度、溶劑濃度、溫度，進行了正交實驗。正交身分程度見表2，正交試驗成果見表3和表4。

正交的統(tǒng)計分析分為直觀和方差分析法兩種[5]，直觀分析法計較簡略、快速，可是會有偏差。方差分析法較精確，但計算步驟煩瑣，結(jié)果出來較慢，二者各有利弊，本文采用兩種方法進行比較分析。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗結(jié)果及極差分析表

表3是直觀分析法的統(tǒng)計分析。直觀分析按下列步驟進行：

①計算各因素同一水平的指標總和T1、T2、T3，

如A因素溫度的1水平T1=45.7

2水平T2=40.9

3水平T3=78.6

同理可得B因素離心時間、C因素離心轉(zhuǎn)速的各水平指標總和。

②計算各因素同一水平的指標平均數(shù)t1、t2、t3，

如A因素的1水平t1=45.7/3=15.23

t2=40.9/3=13.63

t3=78.6/3=26.2

同理可得B因素離心時間、C因素離心轉(zhuǎn)速的各水平指標平均數(shù)。

③計算各列極差R，

A列R=12.55

B列R=6.97

C列R=8.37

按照極差R的大小即可得到各身分對嘗試指標的影響巨細，判定出主次干系。極差越大，該對嘗試指標的影響越大，也便是主要身分，反之便是次要身分[6]。

由上述③的結(jié)果可得A身分為主要身分，B身分次之，C身分最小，它們的主次干系是：A>C>B。

④選出最佳處理組合。

由于本實驗是要找到蛋白質(zhì)的最佳沉淀條件，也就是說提取液中蛋白質(zhì)含量越少條件越優(yōu)，所以A因素應該以1水平為最好，所以B因素和C因素也應該以1水平最好。因此最佳處理組合為扇貝蛋白質(zhì)在溫度為85℃，時間為45min，氯化鈉濃度為10%時效果最好。

表4 正交試驗結(jié)果及方差分析表

表4是方差分析法的統(tǒng)計分析。分差分析按下列步驟進行：

①計算

②總平方和

SST=∑X2-T2/n=6.42+62+14.52+13.32+13.42+14.22+20.22+22.22+29.32-139.52/9=2603.7-2162 =441.7

總自由度dfT=9-1=8，

A因素平方和SSA=(26.92+40.92+71.72)/3-2162.0=350.4，A因素自由度dfA=3-1=2；

B因素平方和SSB=66.9，B因素自由度dfB=3-1=2；

C因素平方和SSC=24.1，C因素自由度dfC=3-1=2。

誤差平均和SSe=SST-SSA-SSB-SSC=0.3

③列方差分析表，作F檢驗。

表5 方差分析表

注：*表示顯著，**表示極顯著

由上表的F與Fa結(jié)果比較可得：

FA、FB>F0.01(2，2)，表明A因素的不同水平對于蛋白質(zhì)的沉淀效果有極顯著差異，溫度和時間是影響扇貝樣液中蛋白質(zhì)含量的主要因素；

F0.05(2，2)FC則又說明B因素比C因素的影響效果更加明顯，但是二者均不如溫度對扇貝蛋白質(zhì)沉淀的影響程度大。

2 結(jié)果

本實驗通過研究貝肉蛋白質(zhì)的提取的最佳條件，最終確定扇貝蛋白質(zhì)在溫度為85℃，時間為45min，氯化鈉濃度為10%時為最佳沉淀條件，但可能出現(xiàn)操作失誤，沒有進行重復實驗，可能會造成結(jié)果不夠準確。

3 討論

實驗中還是存在一些不足和漏洞，比如本實驗沒有進行蛋白質(zhì)沉淀條件的單因素多水平的實驗操作，沒有確定溫度、恒溫水浴時間和氯化鈉濃度的單個因素的最佳條件的范圍趨勢，這樣就缺乏了對蛋白質(zhì)沉淀條件的優(yōu)化。因而直接進行正交試驗缺少了一定的說服力，嚴格意義上不能稱為是蛋白質(zhì)最佳的沉淀條件，因為三個因素分別只設(shè)計了三個水平，范圍較模糊粗糙，說服力較低。這是實驗自身存在的問題，實驗過程中還沒有達到讓蛋白質(zhì)完全沉淀的效果，以上結(jié)果中可以看出蛋白質(zhì)在最佳條件時還能被檢驗出來，本實驗還需要進行改善。