香附四物湯揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的制備、表征與成分分析

席駿鉆，沈錦華，毛全高，李亞南

(如皋市人民醫(yī)院，江蘇 如皋 226500)

香附四物湯首載于清代《不知醫(yī)必要》卷四，是四物湯的重要衍化方之一，由四物湯加香附、木香、延胡索3味藥組成，臨床主要用于氣滯血瘀證原發(fā)性痛經(jīng)的治療[1]。香附四物湯中當(dāng)歸、川芎、香附、木香4味組方藥材富含揮發(fā)性成分，其揮發(fā)油部位活性顯著。中藥揮發(fā)油雖然具有多方面較強的生物活性，但普遍存在的揮發(fā)性與不穩(wěn)定性一直制約著其質(zhì)量控制與藥效發(fā)揮，揮發(fā)油的特異性氣味影響患者的口服順應(yīng)性，且易對胃腸道造成刺激，同時存在溶解度小生物利用度低等問題[2-3]，在香附四物湯新型口服制劑的研究開發(fā)過程中亟待解決。環(huán)糊精包合是較為常用的制劑方法，包合后可使液體藥物固體化，掩蓋藥物不良?xì)馕?，增強其穩(wěn)定性，提高其溶解度及生物利用度等[4-6]。目前β-CD因孔隙適中且成本較低，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛。本實驗將香附四物湯揮發(fā)油制成β-CD包合物，并對其進(jìn)行表征及成分分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HA220-50-07型超臨界萃取裝置(江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司)；85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；MS105電子分析天平(Mettler Toledo公司)；Diamond差示掃描量熱儀(美國Perkin Elmer公司)；Tensor 37紅外光譜儀(德國Bruker公司)；D/max-2500/PC型轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；JSM-5610LV掃描電子顯微鏡(日本JEOL公司)；EPED超純水機(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)；冷凍干燥機(Labconco公司)；AxION iQT型GC-MS/MS聯(lián)用儀(PerkinElmer公司)；NIST2011、wiley9質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫。

1.2 試藥

β-CD(江蘇豐園生物技術(shù)有限公司)；當(dāng)歸(批號130912)、川芎(批號130913)、香附(批號130912)、木香(批號130908)藥材購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，按2015年版中國藥典項下要求檢驗均符合標(biāo)準(zhǔn)；甲醇(色譜純，Tedia)，其他所用試劑均為分析純，超純水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物的制備

按處方比例稱取當(dāng)歸、川芎、香附、木香藥材粗粉(10目)共840 g混合，采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取XFSWO約10 mL。根據(jù)預(yù)實驗及相關(guān)參考文獻(xiàn)[7-9]，采用飽和水溶液法制備XFSWO/β-CD包合物。將β-CD用蒸餾水水浴加熱使其完全溶解，制成飽和溶液。降至規(guī)定溫度，于磁力攪拌器上恒溫攪拌(500 r/min)，并將揮發(fā)油逐滴滴入β-CD飽和溶液中，攪拌一定時間后停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫，置4℃冰箱冷藏24 h，抽濾，將沉淀物用乙醚淋洗3次，每次5 mL，冷凍干燥得白色粉末即為XFSWO/β-CD包合物。影響揮發(fā)油包合工藝的主要因素有揮發(fā)油與β-CD比例、包合溫度、包合時間，故根據(jù)L9(34)正交設(shè)計進(jìn)行試驗，因素水平見表1，正交試驗設(shè)計見表2。

表1 正交設(shè)計因素水平表

以揮發(fā)油包合率、包合物收得率及包合物含油率為評價指標(biāo)。包合率(y1)作為包合工藝篩選的主要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定為0.6；收得率(y2)與含油率(y3)作為兩個次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)均定為0.2。將正交設(shè)計的9個實驗中各指標(biāo)最大者計為1，其余各值按比例折算后乘以相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)再求和，即為綜合評分y。采用2015年版中國藥典一部附錄XD揮發(fā)油測定法測定空白回收率及包合物中揮發(fā)油量，正交試驗結(jié)果見表2，數(shù)據(jù)分析見表3。

y1=包合物中揮發(fā)油量/(揮發(fā)油投入量×空白回收率)×100%

y2=包合物收得量/(β-CD投入量+揮發(fā)油投入量)×100%

y3=包合物中揮發(fā)油量/(包合物收得量×空白回收率)×100%

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果(%)

表3 方差分析結(jié)果

由正交試驗結(jié)果的直觀分析和方差分析可知，各因素對包合效果的影響程度為A>B>C，其中因素A對包合工藝有顯著影響，因素B次之，因素C無明顯影響。最終確定飽和水溶液法包合工藝為A3B2C1，即XFSWO:β-CD 1:10(mL:g)，包合溫度40℃，包合時間1 h。按此工藝進(jìn)行驗證實驗，3次平行實驗所得結(jié)果如下：揮發(fā)油包合率分別為77.11%、78.32%、77.93%，包合物收得率分別為47.22%、48.06%、46.95%，包合物含油率分別為7.86%、6.97%、7.04%，該工藝條件穩(wěn)定可行。

2.2 包合物的表征

XFSWO、XFSWO/β-CD包合物(制備同前)；XFSWO/β-CD物理混合物：將1 mL XFSWO與10 g β-CD充分混勻制成物理混合物，用于對比研究。

2.2.1 差示掃描量熱法(DSC)

稱取β-CD、XFSWO/β-CD物理混合物、XFSWO/β-CD包合物各4 mg，置于鋁制坩堝內(nèi)，以氮氣為保護(hù)，流速40 mL/min，升溫速度10℃/min，升溫范圍25～350℃，結(jié)果如圖1所示。β-CD與藥物分子的包合是焓、熵共驅(qū)過程，吸熱峰的消失、峰型變寬、峰的轉(zhuǎn)移或新峰產(chǎn)生表明晶格、熔點、沸點、升華點等的改變[10]。β-CD在112℃有吸熱峰，物理混合物峰型與β-CD基本相似，包合物則發(fā)生明顯改變，吸熱峰轉(zhuǎn)移至68℃，峰型變寬，熱熵值減小，表明生成了新的物相。

注：a.β-CD;b.物理混合物；c.包合物圖1 β-CD、物理混合物、包合物差示熱分析圖譜

2.2.2 紅外光譜法(IR)

稱取β-CD、XFSWO/β-CD物理混合物、XFSWO/β-CD包合物各5 mg，以質(zhì)量比1:100與光譜級溴化鉀粉末混合壓片進(jìn)行紅外光譜分析，分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～600 cm-1，結(jié)果如圖2所示。XFSWO/β-CD物理混合物在2 935、1 767、710 cm-1處有較強的吸收峰，而XFSWO/β-CD包合物在相應(yīng)波長處吸收峰消失或吸收強度減弱，與β-CD光譜圖較為接近，表明藥物分子被包合至β-CD疏水空腔中形成了包合物[11]。

注：a.β-CD;b.物理混合物；c.包合物圖2 β-CD、物理混合物、包合物紅外光譜圖

2.2.3 X射線衍射法(XRD)

稱取β-CD、XFSWO/β-CD物理混合物、XFSWO/β-CD包合物各10 mg進(jìn)行X射線衍射分析，條件如下：室溫，銅靶，石墨單色器，管壓40 kV，管流100 mA，DS=SS=1°，RS=0.3 mm，結(jié)果如圖3所示?？瞻爪?CD圖譜顯示出眾多的衍射峰，證明其有晶體結(jié)構(gòu)[12]；由于XFSWO為液體藥物，沒有衍射峰的產(chǎn)生，因此XFSWO/β-CD物理混合物的衍射峰型與空白β-CD基本一致；而XFSWO/β-CD包合物的衍射圖譜表現(xiàn)為較少數(shù)量和較弱強度的衍射峰，表明形成包合物后晶體性質(zhì)發(fā)生顯著變化，由晶型轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型或半晶型[13-14]，從而證明了包合物的生成。

注：a.β-CD;b.物理混合物；c.包合物圖3 β-CD、物理混合物、包合物X射線衍射圖譜

2.2.4 掃描電子顯微鏡(SEM)

稱取β-CD、XFSWO/β-CD物理混合物、XFSWO/β-CD包合物各10 mg，經(jīng)鍍金預(yù)處理后，用SEM觀察各自的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果見圖4?？瞻爪?CD為晶體結(jié)構(gòu)，XFSWO/β-CD物理混合物只是單純兩物質(zhì)間的相互混合，而XFSWO/β-CD包合物的形態(tài)和晶型卻發(fā)生了重大變化，表明XFSWO/β-CD包合物已經(jīng)形成。

注：a.β-CD;b.物理混合物；c.包合物圖4 β-CD、物理混合物、包合物電鏡圖

2.3 包合物的成分分析

2.3.1 供試品溶液的制備

稱取XFSWO約10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為XFSWO的供試品溶液；稱取XFSWO/β-CD包合物約100 mg，置于量瓶中，加10 mL甲醇稀釋至刻度，超聲30 min，用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為XFSWO/β-CD包合物的供試品溶液。

2.3.2 GC-MS分析條件

色譜條件：Agilent HP-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：起始柱溫60℃，保持4 min，以2℃/min升溫至110℃后，再以1℃/min升溫至160℃，最后以10℃/min升溫至250℃，保持3 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦氣，流速1 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比1∶ 20；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源溫度250℃；電離方式：EI，電子能量70 eV；溶劑延遲4 min；掃描質(zhì)量范圍m/z 35～500。

2.3.3 GC-MS分析結(jié)果

GC-MS總離子流圖見圖5，由圖可知XFSWO包合前后色譜峰的數(shù)目及位置沒有明顯變化，表明β-CD包合未對XFSWO中主要成分的化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響，但峰高的差異則提示組分含量發(fā)生了一定改變。根據(jù)各色譜峰的質(zhì)譜信息，通過AxION eCipher工作站及NIST2011、wiley9標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫進(jìn)行計算機檢索比對和人工解析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15]鑒定了XFSWO及XFSWO/β-CD包合物中的主要化學(xué)成分，并按峰面積歸一化法分別計算各成分在XFSWO及XFSWO/β-CD包合物中所占的百分含量，結(jié)果見表4，部分化學(xué)成分的含量發(fā)生了較大變化。

圖5 XFSWO(a)、XFSWO/β-CD包合物(b)總離子流圖

表4 XFSWO、XFSWO/β-CD包合物的化學(xué)成分分析

3 討論

中藥揮發(fā)油療效顯著，但在傳統(tǒng)中藥劑型的制備過程中并未得到關(guān)注，利用環(huán)糊精包合技術(shù)可達(dá)到增加揮發(fā)性成分的溶解度和溶出度、提高其生物利用度及穩(wěn)定性、固體化和降低毒副作用等目的[16]，尤其適用于中藥揮發(fā)油的制劑研究。目前，表征藥物-環(huán)糊精包合物的方法較多，可分別從熱分析、光譜學(xué)、色譜學(xué)等方面的性質(zhì)差異對其進(jìn)行驗證[17-18]。

包合是藥物分子與環(huán)糊精分子通過非共價鍵相互結(jié)合[19]，是一種物理作用而不產(chǎn)生化學(xué)變化，故XFSWO包合前后主要化學(xué)成分種類未發(fā)生改變。分子大小、空間構(gòu)型、基團(tuán)性質(zhì)等因素在很大程度上影響包合物的形成及穩(wěn)定性[20]。由于XFSWO中不同組分分子大小與結(jié)構(gòu)的差異，其與β-CD形成包合物時存在選擇性與競爭性，結(jié)合能力各不相同，從而導(dǎo)致包合前后組分的含量發(fā)生了變化。某些組分與β-CD分子空腔的尺寸匹配、作用適宜、選擇性好，易與β-CD結(jié)合形成包合物且較為牢固，包合之后含量相對升高；而另一些組分恰好相反，它們不易進(jìn)入β-CD分子空腔形成包合物或形成的包合物穩(wěn)定性較差，與β-CD結(jié)合不牢靠，易從β-CD分子空腔中游離出來。制備過程中，利用乙醚淋洗去除吸附在β-CD表面的游離揮發(fā)油時，可能將這類成分一同洗脫出來；冷凍干燥也可能造成該類成分的損失，導(dǎo)致其在包合物中的含量降低。此外，含量變化還可能與成分的穩(wěn)定性有關(guān)，穩(wěn)定性較差的化合物在包合過程中可能發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化導(dǎo)致含量降低，而其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量可能升高，因此在包合過程中應(yīng)盡量降低包合溫度、縮短包合時間等。