親水親脂-離子液體涂層復(fù)合固相萃取填料在黃曲霉毒素M1檢測中的應(yīng)用

尚欣春，沙芮，錢瀅文，洪霞

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所，蘭州 730010；2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測有限公司，蘭州 730010）

0 引 言

黃曲霉毒素M1屬于黃曲霉毒素(Aflatoxins)一類結(jié)構(gòu)相似的化合物中的一種，該類毒素是由常見的黃曲霉菌(Asperillus Flavus)和寄生曲霉菌(Asperillus Parasiticus)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,可以由黃曲霉毒素B1在體內(nèi)的肝微粒體單氧化酶系催化下，生成AFM 1，也可由一些黃曲霉菌和寄生曲霉直接產(chǎn)生[1]。AFM 1的呋喃環(huán)環(huán)氧結(jié)構(gòu)與體內(nèi)DNA嘌呤殘基共價(jià)結(jié)合,從而造成DNA的某些損傷，引起DNA結(jié)構(gòu)和功能的改變，產(chǎn)生癌變。由于缺乏行之有效的防治和去毒方法,因此針對食品特別是乳制品，制定嚴(yán)格的AFM 1限量標(biāo)準(zhǔn)就尤為重要，中國對嬰兒乳品中AFM 1的限量標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出，及牛乳中0.5μg/kg。限量標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施必須建立靈敏、準(zhǔn)確、快捷的檢測方法，自發(fā)現(xiàn)牛奶中含有AFM 1以來，對AFM 1的檢測方法各國科學(xué)家做了大量的研究[2]，取得了很大的進(jìn)展，現(xiàn)分類介紹如下。

薄層色譜法(TLC)樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后,AFM 1在波長的紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的最低檢出量與標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度相比較來測定含量。TLC操作復(fù)雜，AFM 1標(biāo)準(zhǔn)品濃度較高，潛在的污染性較高，特異性較差，靈敏度也相對較差，檢測耗時(shí)長，檢出限量為0.3μg，樣品回收率為67%(鮮奶)，和80%(奶粉)，不適合大批量樣品檢測[3-4]。需提取凈化的分析方法樣品前處理操作煩瑣，復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，勞動(dòng)強(qiáng)度大。ELISA法相比而言，操作簡便，快捷，污染較小，靈敏度也較高，適合批量樣品的普檢和篩選，但存在假陽性和假陰性的可能，且只能半定量[5]。高效液相色譜法（HPLC）自動(dòng)化程度高，穩(wěn)定性好，靈敏度高，但樣品前處理中一般采用免疫親和柱、C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱等。均有不同特點(diǎn)，免疫親和柱特異性好，但成本高，操作繁瑣[6-8]；C18柱操作要求高，且目標(biāo)物容易殘留在柱體內(nèi)，影響回收率；以二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物為代表的聚合物基質(zhì)SPE填料（HLB）自出現(xiàn)以來就備受分析者的青睞。這種吸附劑是由親脂性的二乙烯苯和親水性的N－乙烯吡咯烷酮按照一定比例共聚而成，同時(shí)具有反相吸附及正相保留的特征，因此適用于極性及非極性化合物的分析。同時(shí)，因?yàn)楸江h(huán)和N－乙烯吡咯烷酮官能團(tuán)作為該填料的骨架結(jié)構(gòu)存在，不會(huì)因干枯而發(fā)生團(tuán)聚，因此在實(shí)際使用過程中，既可以免去活化步驟，又可以不用擔(dān)心柱床干枯造成回收率下降。其柱回收率，穩(wěn)定性都很良好。雖然親水親脂共聚物微球在檢測中應(yīng)用較多，但使用方法均為滴加式的萃取柱，上樣、淋洗、洗脫時(shí)液體只能緩慢滴落，一般固相萃取時(shí)間為20～30 min[9]。而如何以共聚物微球?yàn)楣滔噍d體，在其表面進(jìn)一步修飾其他特殊物質(zhì)，加速其萃取速度同樣值得探索[10-15]。

離子液體是一種結(jié)構(gòu)及性質(zhì)可塑性很強(qiáng)的室溫熔融鹽，在合成催化，分離萃取，電化學(xué)等方面應(yīng)用很廣[16-17]。其中咪唑類離子液體對具有共軛結(jié)構(gòu)的物質(zhì)有良好的吸附特性。而將離子液體作為涂層，涂覆在二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物固相載體表面形成固載化離子液體，同樣能顯現(xiàn)出不同性質(zhì)[18-19]。如何在此基礎(chǔ)上探索對乳制品中AFM 1具有快速、高效、穩(wěn)定吸附的新型固相萃取填料，尚未有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N-甲基咪唑，分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；1-氯正辛烷，優(yōu)級(jí)純，上海麥克林生化科技有限公司；六氟磷酸鉀，分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；AFM 1標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品（97.5%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；聚乙烯醇，分析純（500 U/mL），阿拉丁試劑上海有限公司；N－乙烯吡咯烷酮，色譜純，北京百靈威科技有限公司；二乙烯苯，分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；偶氮二異丁腈，分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；柱層析用200-300目硅膠，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；中性氧化鋁，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；大孔樹脂，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；弗羅里硅土，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；C18固相萃取填料，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；牛奶陰性樣品，蘭州莊園乳業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀，島津20A，配熒光檢測器，島津科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；離心機(jī)，RX-II型，天美中國科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 離子液體合成

根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：1-辛基-3-甲基咪唑氯化鹽的合成（[C8MIM]Cl）：稱取0.25 mol（20.53 g）N-甲基咪唑和0.258 mol（23.88 g）1-氯正辛烷于100 mL燒瓶中，加熱回流24 h，用熱乙酸乙酯多次洗滌反應(yīng)后的液體，棄去乙酸乙酯，70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到淡黃色粘稠液體，備用；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的合成（[C8MIM][PF6]）：稱取1-辛基-3-甲基咪唑氯化鹽35 g溶于150 mL蒸餾水中，加入六氟磷酸鉀48 g，攪拌0.5 h，分為兩層，棄去上層后，用蒸餾水反復(fù)洗滌除去氯離子，在洗滌過離子液體的水中滴加0.1 mol/L的硝酸銀溶液，直到不產(chǎn)生白色沉淀，證明氯離子洗滌干凈。70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除水分，得到淡黃色黏稠液體。將該液體溶于200 mL色譜純甲醇中，加入10 g活性炭脫色。取上清液過大孔樹脂固相萃取柱，接收全部流出液，70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余溶劑。得到無色透明黏稠液體，備用。

1.3.2 固相載體二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球合成

根據(jù)文獻(xiàn)[11]修改如下：向250份三口燒瓶中加入75 mL蒸餾水和1 g聚乙烯醇粉末充分?jǐn)嚢枞芙庾鳛榉稚⑾鄠溆?。精密量?5 mL甲苯5 mL正辛烷9 gN－乙烯吡咯烷酮和15 g二乙烯苯至小燒杯中加入0.15 g偶氮二異丁腈混勻后倒入三口燒瓶中快速攪拌30 min加熱至80℃冷凝回流，1 500 r/min攪拌反應(yīng)12 h后停止反應(yīng)，用水和甲醇清洗產(chǎn)物，于80℃下真空干燥4 h得二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球，該共聚物微球粒徑大小為30～50μm。

1.3.3 離子液體固載化

秤取干燥的二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球10 g，加入1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體4 g，甲醇15 mL，超聲處理30 min。于60℃下真空干燥2 h得到固相萃取填料。

1.3.4 該填料固相萃取柱裝填

稱取400 mg固相萃取填料于注射式固相萃取套管中，壓實(shí)填料，加蓋玻璃纖維墊片，給套管加蓋。得到AFM 1注射式超快速固相萃取柱。如圖1所示。

圖1 AFM1注射式超快速固相萃取柱

1.3.5 試劑準(zhǔn)備

105 g/L亞鐵氰化鉀水溶液，220 g/L乙酸鋅3%乙酸水溶液，1 mol/L p H 7.0乙酸銨緩沖液。

1.3.6 樣品前處理方法

稱取發(fā)酵乳及固體乳粉、乳酪樣品5 g，加30 mL水加熱溶解；液態(tài)乳樣品直接稱取35 g，在樣品液中加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，5 mL乙酸鋅溶液，充分搖勻后再加入5 mL緩沖鹽溶液，于5 000 r/min離心3 min。得到沉淀和上清液，上清液待凈化富集。

1.3.7 固相萃取過程及檢測方法

圖2 AFM1標(biāo)準(zhǔn)及樣品色譜圖

取自制固相萃取柱，用注射器向萃取柱中加入得到的所有樣品上清液，棄去流出液?？刂戚腿∷俣刃∮?5 mL/min，即單個(gè)樣品上清液全部流出所需時(shí)間為2 min。上清液全部留出后，用注射器加入5 mL蒸餾水淋洗，棄去流出液，并通過10 mL空氣，將萃取柱中殘留水吹出。用注射器加入2 mL甲醇，并通過5 mL空氣，吹出萃取柱中液體，收集所有流出液，將流出液定容至2.00 mL。過0.45μm濾膜。進(jìn)行高效液相色譜儀測定。色譜條件：色譜柱：C18 4.6×250 mm分析柱；流動(dòng)相：水+乙腈（v）=60+40；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL；激發(fā)波長：365 nm，發(fā)射波長：425 nm。得到標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品色譜圖，如圖2所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體對AFM 1吸附pH條件

分別用0.5 mol/L p H值為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0的乙酸銨緩沖液，配制0.1 μg/mL的AFM 1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.7方法處理上述11中溶液，進(jìn)入液相色譜儀測定。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)樣品液p H＜6時(shí)，酸性漸強(qiáng)，AFM 1容易與H+結(jié)合生成正離子鹽，吸附能力減弱；當(dāng)p H＞8時(shí)，堿性漸強(qiáng)，AFM 1容易生成負(fù)離子鹽，吸附能力減弱。該填料對正負(fù)離子鹽類吸附效果不佳，僅對有共軛結(jié)構(gòu)的AFM 1有良好吸附。所以在樣品前處理步驟加入pH 7.0的緩沖溶液。

圖3 固相萃取柱對不同pH樣品處理液的吸附效果

2.2 填料中離子液體與固相載體比例及萃取速度對吸附效果的影響

按1.3.3方法，制作離子液體與固相載體質(zhì)量比分別為 0∶10，0.5∶10，1∶10，2∶10，3∶10，4∶10，5∶10，7∶10，10∶10，20∶10，的固相萃取填料，并制作固相萃取柱，使用上述固相萃取柱，按照1.3.6和1.3.7方法選擇不同萃取速度處理50 ng/g的加標(biāo)純牛奶陰性樣品，所測得結(jié)果如表1所示。選擇檢測結(jié)果最接近50 ng/g，且消耗時(shí)間最短，試劑最少的條件為最優(yōu)條件。

由表1可知，僅使用固相載體，不固載離子液體時(shí)，雖然固相載體對AFM 1有一定的吸附效果，且隨過柱時(shí)間的增加吸附效果增加，但是增加的效果不夠理想，所以單純使用二乙烯苯－N－乙烯吡咯烷酮共聚物微球吸附AFM 1，樣品前處理耗時(shí)過長。隨著離子液體比例增加，固相萃取柱對目標(biāo)物的吸附效果也明顯增加，當(dāng)比例達(dá)到4∶10的時(shí)候，繼續(xù)增加離子液體比例，吸附效果增加緩慢，反而會(huì)增加檢測成本，所以綜合考慮選擇最佳條件為，離子液體與固相載體比例為4∶10，30 mL樣液過柱時(shí)間為2 min。

2.3 固相萃取柱中填料用量對吸附效果的影響

分別稱取 100 mg，200 mg，300 mg，400 mg，500 mg，600 mg，700 mg，800 mg，1000 mg固相萃取填料，按1.3.4方法制作含有不同質(zhì)量填料的固相萃取小柱，按照1.3.6和1.3.7方法處理50 ng/g的加標(biāo)純牛奶陰性樣品，所測得結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)填料質(zhì)量＜400 mg時(shí)由于樣品液需要快速過柱，填料過少不能有效的吸附目標(biāo)物；當(dāng)400 mg≤填料質(zhì)量≤600 mg時(shí)，填料具有良好吸附；當(dāng)600 mg＜填料質(zhì)量時(shí)，由于填料過多，在洗脫步驟，2 mL洗脫液不能將所有目標(biāo)物洗脫，所以檢測結(jié)果會(huì)偏低?？紤]檢測成本，選擇每只固相萃取柱含有400 mg填料。

表1 不同離子液體與載體比例及不同萃取速度對萃取效果的影響 ng/g

圖4 填料質(zhì)量對萃取效果影響

2.4 多種固相載體對比

選用硅膠，中性氧化鋁，大孔樹脂，弗羅里硅土，C18固相萃取填料及本實(shí)驗(yàn)合成的共聚物微球分別作為固相載體，按1.3.3方法制作離子液體固載化填料及固相萃取柱。按照1.3.6和1.3.7方法處理50ng/g的加標(biāo)純牛奶樣品，所測得結(jié)果及樣品液經(jīng)過固相萃取柱時(shí)的現(xiàn)象如表2所示。

表2 不同材料作為離子液體的固相載體及其萃取效果

由表2可知，硅膠、中性氧化鋁、弗羅里硅土為載體制作的固相萃取柱在萃取樣液時(shí)均流出乳白色液體懸濁液，待懸濁液分層后，下層為少量離子液體。說明這三種載體與離子液體之間作用力很微弱，外力作用下離子液體很容易從載體上脫落，導(dǎo)致吸附能力差，檢測結(jié)果偏低。大孔樹脂為載體的固相萃取柱在萃取樣液時(shí)均流出清澈液體，但上樣時(shí)阻力很小，觀察發(fā)現(xiàn)同樣400 mg大孔樹脂-離子液體填料比其他填料體積大，說明該填料非常松散，無法將目標(biāo)物完全萃取。C18填料為載體的固相萃取柱在萃取樣液時(shí)均流出清澈液體，但上樣時(shí)阻力很大，因?yàn)樗芤号cC18填料兼容性很差，不利于萃取進(jìn)行。而親水-親脂的共聚物微球-離子液體填料，既滿足載體與離子液體之間的作用力很牢固，同時(shí)滿足與上樣液兼容性良好。

2.5 固相萃取柱最大吸附上限

按1.3.3方法制作固相萃取柱。用p H為7的乙酸銨緩沖液分別配制含有AFM 1含量為100 ng，200 ng，500 ng，1 000 ng，2 000 ng，4 000 ng，5 000 ng，5 500 ng，6 000 ng，7 000 ng，8000 ng的溶液30 mL。按照1.3.6和1.3.7方法處理上述溶液，所測得結(jié)果如圖5所示。

圖5 一定質(zhì)量的填料可有效吸附黃曲霉毒素M1最大質(zhì)量

由圖5可知，當(dāng)樣液中AFM 1含量≤5 000 ng時(shí)，400 mg容量的固相萃取柱能快速、穩(wěn)定、高效的萃取其中目標(biāo)物。國家標(biāo)準(zhǔn)限量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于5 000 ng，所以該固相萃取柱的柱容量也完全滿足正常檢測需要。

2.6 方法加標(biāo)回收率及方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按照1.3.6和1.3.7方法處理三個(gè)加標(biāo)水平的純牛奶陽性樣品，每個(gè)樣品6平行，回收率及RSD值結(jié)果圖表3所示。

由表3可知，該方法回收率為90.1%～92.7%，RSD%≤2%，證明該方法結(jié)果穩(wěn)定，滿足檢測要求。

2.7 方法線性范圍、線性方程、檢出限參數(shù)

以線性范圍評(píng)價(jià)該方法的檢測濃度范圍，當(dāng)3倍信噪比對應(yīng)的濃度為儀器檢出限，以最低檢出限評(píng)價(jià)該方法靈敏度，結(jié)果見表4。

由表4可知，該方法線性良好。方法采用濃縮的方式處理樣品，固體乳樣品濃縮2.5倍，液體乳樣品濃縮17.5倍，所以固體乳樣品方法檢出限為0.4 ng/g，液體乳樣品方法檢出限為0.06 ng/g。該方法靈敏度高，適合AFM 1的痕量檢測。

表3 黃曲霉毒素M1 3個(gè)加標(biāo)水平，實(shí)際樣品回收率及RSD值實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.8 方法實(shí)際應(yīng)用

在市場及超市隨機(jī)抽取50份樣品，其中純牛奶20份，酸奶10份，乳飲料10份，奶糖4份，奶油3份，奶酪3份。按照1.3.6和1.3.7方法處理，并檢測其中AFM 1含量。50份樣品中僅有一份純牛奶樣品出現(xiàn)漲袋現(xiàn)象，且樣品有沉淀出現(xiàn)，該樣品AFM 1含量為1.53 ng/g。其余樣品均未檢出含有AFM 1。

3 結(jié) 論

提出超快速固相萃取的想法，固相萃取過程僅需2 min。并結(jié)合親水親脂共聚物微球-離子液體涂層，形成復(fù)合固相萃取填料在pH為6～8時(shí)，對乳及乳制品樣品處理液中AFM 1吸附能力強(qiáng)，吸附速度快，吸附效果穩(wěn)定。整個(gè)試驗(yàn)操作簡便快捷。克服了常規(guī)液相色譜法中操作繁瑣，萃取柱高成本，前處理耗時(shí)長的缺點(diǎn)。同時(shí)該方法回收率、精密度良好，準(zhǔn)確度高，重顯性好，在實(shí)際樣品中應(yīng)用良好。為超快速固相萃取及AFM 1檢測方法提供參考。