錦燈籠抗炎活性成分作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

楊麗軍，王丹丹，吳紅杰，陳大忠

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040）

錦燈籠為茄科植物酸漿 [Physalis alkekengi L.var.franchet ii（Mast．）Makino]的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼。2015版《中國(guó)藥典》收載，具有清熱解毒，利咽化痰等功效，主要用于咽痛音啞、痰熱咳嗽等癥狀，是常用的清熱解毒藥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，錦燈籠具有抗炎的作用[2-4]。然而炎癥發(fā)生的發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，而中藥錦燈籠的化學(xué)成分復(fù)雜，目前對(duì)錦燈籠抗炎作用機(jī)制尚未完全闡明。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究理念，借助網(wǎng)絡(luò)分析方法篩選錦燈籠中的活性成分，并構(gòu)建藥物分子靶點(diǎn)-疾病之間的相互作用關(guān)系，實(shí)現(xiàn)活性成分與機(jī)體內(nèi)靶點(diǎn)及效應(yīng)分子的完美對(duì)接，系統(tǒng)解析并可視化中藥多成分-多靶點(diǎn)-多通路的相互作用關(guān)系，為更全面的研究中藥的藥理作用、作用機(jī)制及拓展新適應(yīng)癥提供新的思路[5-6]。

1 材料與方法

1.1 錦燈籠活性成分的篩選及sdf-mol格式的建立 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TcmSP、TCMPTD和TCMDatabase@Taiwan[7]數(shù)據(jù)庫(kù)，分別檢索錦燈籠的化學(xué)成分，根據(jù)里賓斯基五原則結(jié)合口服吸收利用度（OB）≥30%，類似藥（DL）≥0.18與相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的成分結(jié)合，將收集到小分子化合物最終統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)到TcmSP數(shù)據(jù)庫(kù)。從CA S數(shù)據(jù)庫(kù)中確定活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在Chembiodraw Ultra 12.0軟件中畫出各自的結(jié)構(gòu)圖。

1.2 潛在作用靶點(diǎn)反向預(yù)測(cè) 登陸PharmMapper平臺(tái)，上傳錦燈籠活性成分，采用反向分子對(duì)接技術(shù)，以活性小分子為探針，搜尋其活性成分潛在的作用靶點(diǎn)，匹配結(jié)果根據(jù)z'-score排序，取前30名（10%），并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白分子名稱進(jìn)行校正。在藥物信息數(shù)據(jù)庫(kù)TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過炎癥檢索相關(guān)靶點(diǎn)并篩選，與反向預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，歸納總結(jié)出錦燈籠活性成分抗炎作用的潛在靶點(diǎn)。

1.3 靶點(diǎn)通路注釋分析 通過MAS3.0生物分子功能注釋系統(tǒng)將獲得的錦燈籠活性成分抗炎作用的潛在靶點(diǎn)信息進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋分析，錦燈籠對(duì)應(yīng)的靶蛋白（基因）直接映射到通路上，則靶點(diǎn)富集的通路確定為藥物活性成分對(duì)代謝通路的信號(hào)調(diào)控發(fā)揮藥效的途徑。

1.4 錦燈籠活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.4.0分析軟件的匹配功能，將預(yù)測(cè)的錦燈籠抗炎作用靶點(diǎn)導(dǎo)入，建立錦燈籠活性成分-靶點(diǎn)-代謝通路-疾病作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)代表錦燈籠活性成分、靶點(diǎn)、代謝通路和疾病，當(dāng)活性成分的作用靶點(diǎn)能對(duì)接到作用通路的靶點(diǎn)時(shí)則以邊的形式相連，即為錦燈籠中的某個(gè)活性成分或多個(gè)活性成分作用在同一作用靶點(diǎn)（通路）或多個(gè)靶點(diǎn)（通路）。通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，分析錦燈籠抗炎作用多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 錦燈籠活性成分的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TcmSP、TCM-PTD和TCMDatabase@Taiwan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到錦燈籠活性小分子，通過篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]中錦燈籠的主要藥效成分（如酸漿苦素等）被過濾掉，考慮到目標(biāo)化合物的選取原則，首先必須為錦燈籠的主要成分，最終確定錦燈籠的活性成分54個(gè)。平均相對(duì)分子質(zhì)量為284.48，氫鍵給體數(shù)目均值為0.84，氫鍵受體數(shù)目均值為2.0，見表1。

表1 錦燈籠主要化學(xué)成分信息

2.2 潛在作用靶點(diǎn)反向預(yù)測(cè) 通過PharmMapper平臺(tái)收集到的潛在作用靶點(diǎn)，匹配結(jié)果根據(jù)z'-score排序，取前30名（10%）與TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的抗炎作用相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)比分析，歸納總結(jié)出12個(gè)可能與錦燈籠抗炎作用相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)（蛋白或基因）。通過預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的頻次發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用的促分裂素原活化激酶14（MAPK14）、血清白和核受體 Rora（RORA）等是錦燈籠主要活性成分潛在靶點(diǎn)蛋白群，MAPK14、白蛋白（ALB）和RORA等是其潛在靶點(diǎn)基因群，見表2。

表2 錦燈籠活性成分的潛在靶點(diǎn)信息

2.3 靶點(diǎn)通路注釋分析 將錦燈籠活性成分預(yù)測(cè)出的12個(gè)作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入MAS.3.0生物分子功能注釋系統(tǒng)，通過通路注釋和分析對(duì)靶點(diǎn)所在的通路進(jìn)行富集并整合各個(gè)通路中靶點(diǎn)富集程度，得到三條富集分支：生物過程、分子功能和細(xì)胞組分。通過GO分析探討錦燈籠預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的功能分布，圖1為錦燈籠抗炎作用預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果。其中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)在生物過程中signal transduction、proteolysis、metabolism排列靠前；在分子功能中zinc ion binding、protein binding比例最大；在細(xì)胞組分中bind（cytoplasm、cytosol、extracellular region、nucleus）關(guān)系密切，見圖1。通過KEGG分析探討錦燈籠抗炎作用預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的通路分布，見圖2。其中12個(gè)靶點(diǎn)參與的通路富集有GnRH signaling pathway、Leukocyte transendothelial migration、PPAR signaling pathway、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection、VEGF signaling pathway MAPK signaling pathway等16條，預(yù)測(cè)為錦燈籠抗炎活性成分潛在作用代謝通路。

2.4 錦燈籠活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將MAS.3.0通路注釋得到的數(shù)據(jù)，通過Cytoscape3.4.0軟件構(gòu)建錦燈籠活性成分作用靶點(diǎn)代謝通路-疾病網(wǎng)絡(luò)模型，如圖3所示。Network Analyzer結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)為86，網(wǎng)絡(luò)密度為0.043，網(wǎng)絡(luò)直徑為6，網(wǎng)絡(luò)半徑為4，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.354、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性：1.362，最短路徑為6 642，特征路徑長(zhǎng)度為3.023，平均網(wǎng)絡(luò)度為3.628。如圖3所示，從成分、靶點(diǎn)、通路的富集程度結(jié)合中節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度分析，Cycloartanol、Cetene、Physalin D、Obtusifoliol、Beta-sitosterol、luteolin等甾體、甾醇、黃酮類化合物為錦燈籠抗炎的主要活性成分；MAPK14、ALB、RORA等為主要的潛在靶 點(diǎn) 基 因 ；Leukocyte transendothelial migration、GnRH signalingpathway為主要的代謝通路。錦燈籠中 Physalin B、Physalin D、Beta-sitosterol、Obtusifoliol等24種成分作用于MAPK14靶點(diǎn)基因上，且MAPK14靶點(diǎn)基因作用于GnRH信號(hào)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等9條代謝通路，同時(shí)Physalin D還作用于 HSP90AA1、MMP2、MMP8、NR3C1 靶點(diǎn)上，說明錦燈籠中存在不同活性成分共同作用同一靶點(diǎn)的現(xiàn)象，也存在一個(gè)化合物與多個(gè)靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，靶點(diǎn)與通路的關(guān)系同成分與靶點(diǎn)，體現(xiàn)了錦燈籠多成分-多靶點(diǎn)-多通路相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)藥物作用機(jī)制。

圖1 錦燈籠活性成分潛在靶點(diǎn)的生物過程（A）、細(xì)胞組分（B）、分子功能（C）的GO富集信息

圖2 錦燈籠主要活性成分潛在靶點(diǎn)的KEGG通路注釋分析

圖3 錦燈籠主要活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病的網(wǎng)絡(luò)模型

3 討論

研究采用“反向分子對(duì)接”的方法虛擬篩選成分，結(jié)合DrugBank和TTD抗炎作用分析發(fā)現(xiàn)12個(gè)錦燈籠抗炎相關(guān)靶點(diǎn),并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路注釋分析,確定16條生物過程的代謝通路，主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、一氧化氮生物合成的正調(diào)控、新陳代謝、蛋白水解等生物過程，與人體應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)代謝、類固醇代謝等生命活動(dòng)密切相關(guān)，從而發(fā)揮抗炎效果[10]。本研究預(yù)測(cè)錦燈籠主要活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病的網(wǎng)絡(luò)中,從化合物的網(wǎng)絡(luò)特征來看54個(gè)活性小分子中節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)度大于2的有38個(gè)化合物，其中包括Luteolin、β-sitosterol等甾體、甾醇、黃酮類化合物。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)Luteolin可以減少脂多糖（LPS）激活的巨噬細(xì)胞MH-S細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子（T NF-α、IL-6）和炎癥介質(zhì)NO、PGE2發(fā)揮抗炎活性。Luteolin在一定程度上與非甾體抗炎藥的作用機(jī)制重合，更有研究表明Luteolin可通過影響Toll-likereceptor signaling pathway下調(diào)免疫細(xì)胞中的NF-κB因子的活性，劑量依賴性的抑制LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中的促炎癥標(biāo)記物的表達(dá)，從而抑制炎癥介質(zhì)的活動(dòng)，達(dá)到抗炎的效果[12]。網(wǎng)絡(luò)模型中的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，錦燈籠可能主要通過MAPK14、MMP2等靶點(diǎn)調(diào)節(jié)發(fā)揮抗炎作用，而MAPK14是介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)換與傳遞的重要蛋白，最初被認(rèn)為是活化的免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到的酪氨酸磷酸化蛋白，在炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)中起重要作用，參與多種類型細(xì)胞的存活、凋亡、增殖分化過程，以及對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等生理過程[13]。結(jié)果中，MAPK14作用在Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、Epithelial cell signaling in Helicobacter pyloriinfection等9條代謝通路，目前已經(jīng)證實(shí)，MAPK14可通過作用激活的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白。MMP2參與正常生理過程中的細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，可以通過炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)并進(jìn)行調(diào)節(jié)，也可通過促進(jìn)VEGF動(dòng)員和產(chǎn)生抗血管生成因子在腫瘤內(nèi)血管生成中起重要作用[14-15]。PPARG在哺乳動(dòng)物脂肪形成中起重要作用，通過作用于過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，用于治療肥胖癥，動(dòng)脈粥樣硬化等癥狀[16]?？傊?，抗炎作用結(jié)合位點(diǎn)與錦燈籠干預(yù)靶點(diǎn)能體現(xiàn)在相同的分子網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，通過成分與靶點(diǎn)及通路的相互作用，進(jìn)而影響整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)功能，這也許就是錦燈籠抗炎作用的分子作用機(jī)制之一。