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    通竅散瘀方微乳的制備及評價*

    2018-10-22 10:09:08張紫薇譚佳威李鵬躍杜守穎
    天津中醫(yī)藥大學學報 2018年5期
    關(guān)鍵詞:微乳載藥通竅

    賈 山,張紫薇,譚佳威,楊 冰,白 潔,李鵬躍,杜守穎,陸 洋

    (北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京 100029)

    通竅散瘀方原方為王永炎院士臨床經(jīng)驗方,由葛根、白芍、薄荷腦等藥味組成,用于治療急性腦中風,療效確切。方中主要成分有葛根素、芍藥苷和薄荷腦。主要藥效成分為葛根素、芍藥苷。葛根素具有擴張冠狀動脈、抗心肌缺血,抑制血小板凝集、改善腦循環(huán)[1]、對腦缺血及缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞損傷具有保護作用[2-3]。芍藥苷對腦神經(jīng)元有保護作用[4],薄荷腦在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進葛根素的滲透,當濃度達到5 mg/mL時具有顯著促滲作用[5]。通竅散瘀方在臨床上主要以水煎液給患者。而方中主要藥效成分葛根素在水和油中的溶解度都很低[6],提高葛根素的生物利用度非常必要。為了發(fā)揮該方速效急救的臨床療效,研制一種安全穩(wěn)定并使有效成分能夠直達腦部的劑型非常必要。微乳作為一種新型的納米制劑,具有腦靶向、低刺激性和高穩(wěn)定性的特點。

    本研究首先通過偽三元相圖制備通竅散瘀方微乳,并對其理化性質(zhì)、含量、刺激性進行評價。

    1 材料

    儀器LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司,SPD-M20A,PDA檢測器;LCSolution色譜工作站);磁力攪拌器(金壇區(qū)華城潤華實驗儀器廠);激光粒徑測定儀(Zetasizer Nano ZS,英國馬爾文儀器有限公司);TK-20B型透皮擴散試驗儀(上海皆凱科技貿(mào)易有限公司);葛根素提取物(北京普博欣生物科技有限責任公司,批號PB10624-1);芍藥苷提取物(北京普博欣生物科技有限責任公司);薄荷腦提取物(北京普博欣生物科技有限責任公司,批號PB31210);葛根素對照品(110752-201615);芍藥苷對照品(110736-201441);肉豆蔻酸異丙酯IPM(麥克林);油酸乙酯(北京化工廠);油酸(北京化工廠);蓖麻油聚氧乙烯35(阿達瑪斯試劑公司);辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)(嘉法獅(上海)貿(mào)易有限公司)等;SD大鼠,雄性,體質(zhì)量(180~220)g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司許可證編號:SCXK(京)2006-2009]。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 葛根素在各油相、乳化劑、助乳化劑中的溶解度考察

    2.1.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠柱;甲醇-水(37∶63)(1%醋酸);流速 1.0 mL/min;檢測波長:250 nm,柱溫:25℃,進樣量:20μL。

    2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取葛根素對照品適量,用甲醇溶解并稀釋成濃度為613.000、367.800、122.600、61.300、24.520、2.452 μg/mL 的葛根素標準供試液。按照上述色譜條件,進樣20μL,記錄峰面積。以樣品色譜峰面積A對濃度C進行線性回歸,結(jié)果表明,葛根素在2.452~613μg/mL線性關(guān)系良好,回歸方程為Y=51 121 441.36X-34 622.21,r2=0.999 9。

    2.1.3 精密度實驗 取高、中、低質(zhì)量濃度(613、367.8、2.452 μg/mL),連續(xù)進樣 3 次,記錄峰面積,計算RSD值0.33%、0.17%、0.000 80%。表明儀器精密度良好。

    2.1.4 穩(wěn)定性實驗 分別在2、4、6、8、10、12 h測樣品含量。計算RSD值,RSD值為1.79%,表明12 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

    2.1.5 溶解度實驗 測定葛根素在不同油相(IPM、油酸、油酸乙酯中)、不同乳化劑(EL-35、吐溫80、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、不同助乳化劑(1,2-丙二醇、無水乙醇、丙三醇、PEG400、Transpol p(二乙二醇單乙基醚))中的溶解度。室溫下,在足量的葛根素中,分別加入5 mL的各溶媒,攪拌48 h,使藥物充分溶解。在 3、9、12、24、48 h 取點,每次取300μL。然后于5 000 r/min下離心15 min,精密量取上清液100μL,甲醇定容到10 mL,HPLC測定葛根素含量。結(jié)果見1~2。

    結(jié)果顯示,對于油相,IPM、油酸、油酸乙酯,葛根素在其中的溶解度均小于0.1 mg/g,說明葛根素在油中的溶解度很低,因此選擇這3種油相作進一步的研究。葛根素在3種表面活性劑中的溶解度都大于40 mg/g,且大小差不多,因此選擇這3種乳化劑進行進一步的實驗。對于助乳化劑,葛根素在1,2-丙二醇的溶解度為254.83 mg/g,明顯高于在其他助乳化劑的溶解度。因此選擇這1,2丙二醇作為助乳化劑。

    圖1 葛根素在不同乳化劑中的溶解度

    圖2 葛根素在不同助乳化劑中的溶解度

    圖3 微乳的偽三元相圖

    2.2 微乳油相的篩選 精密稱取EL35作為乳化劑,1,2-丙二醇作為助乳化劑,乳化劑和助乳化劑按質(zhì)量比(Km)為1∶1混合均勻,制成混合乳化劑。將混合乳化劑分別與IP M、油酸乙酯、油酸,按質(zhì)量比 9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8,1∶9 的比例精確稱量,置于西林瓶中,25℃恒溫,350 r/min磁力攪拌混合均勻,以去離子水滴定,每滴一次待其充分混合均勻,觀察液體的形態(tài)變化,同時以入射光照射,觀察是否有丁達爾現(xiàn)象,記錄體系的臨界變化點。計算臨界點時每個組分在微乳體系中的質(zhì)量百分含量,借助O-riginPro8.0軟件繪制微乳的偽三元相圖,確定O/W型微乳區(qū)。結(jié)果見圖3。

    結(jié)果顯示,EL35-1,2丙二醇-IPM-水微乳區(qū)面積最大。微乳區(qū)面積大者,微乳的穩(wěn)定性較好。所以選擇IPM作為油相。

    2.3 微乳乳化劑的篩選 精密稱取IPM作為油相,1,2-丙二醇作為助乳化劑、EL-35、吐溫 80、(Labrasol)為乳化劑,將各乳化劑和助乳化劑按質(zhì)量比(Km)1∶1,混合均勻,制成混合乳化劑。將不同的混合乳化劑與 IPM,按質(zhì)量比 9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8,1∶9 的比例精確稱量,置于西林瓶中,后面的實驗操作同2.2。結(jié)果見圖4。

    結(jié)果顯示,以Labrasol作乳化劑的處方,在任何比例下都不可形成微乳。而以EL35,吐溫80為乳化劑的微乳面積比較,EL35的微乳區(qū)面積大者,選擇乳化劑EL-35。

    2.4 微乳Km值的篩選 精密稱取EL35作為乳化劑和1,2-丙二醇作為助乳化劑按質(zhì)量比(Km)為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 分別混合均勻,制成混合乳化劑。將混合乳化劑與 IPM,按質(zhì)量比 9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8 和 1∶9 的比例精確稱量,置于西林瓶中,后面的實驗操作同2.2。結(jié)果見圖5。

    結(jié)果顯示,當Km=1∶1時,微乳區(qū)面積最大,選擇 Km=1∶1。

    圖4 不同微乳乳化劑的偽三元相圖

    圖5 不同km值的偽三元相同

    2.5 最佳空白微乳處方的篩選 在篩選出的以IPM為油相、EL-35為乳化劑、1,2丙二醇為助乳化劑,Km值為1∶1的偽三元相圖中,篩選13個點作進一步研究。乳化劑的用量一般為處方的40%~60%,油相為5%左右。

    采用馬爾文激光粒徑測定儀,對已經(jīng)選擇的微乳區(qū)域內(nèi)的13個處方進行粒徑和多分散指數(shù)(PDI)測定。以形成微乳的外觀、粒徑、PDI作為衡量指標綜合考慮,選擇最佳處方配比,作為最優(yōu)處方。結(jié)果見表1。

    結(jié)果顯示,處方2、處方5和處方13,外觀澄清透明,PDI小,比較穩(wěn)定。將這3個處方進行進一步實驗。

    2.6 最佳載藥微乳處方的篩選 考察葛根素載藥量 500、600、700、800、900、1 000 mg葛根素。芍藥苷和薄荷腦按照處方比例添加到空白微乳處方中。處方比例為葛根素:芍藥苷:薄荷腦=2∶1∶0.8。將空白處方2,處方5和處方13加入各藥物之后,制得載藥微乳,在常溫下放置,處方13載藥500 mg在第2天析出,處方5載藥500 mg在第10天析出,處方2載藥 500、600、700 mg,放置不析出,根據(jù)最大載藥量原則,最終選擇載藥量700 mg。

    2.7 通竅散瘀微乳處方設(shè)計 設(shè)計空白處方總量為 10 g,IPM 0.519 g,1,2-丙二醇 2.923 g,EL35 2.923 g,水3.635 g,其中載藥葛根素700 mg,芍藥苷280 mg,薄荷腦 350 mg。

    2.7.1 通竅散瘀微乳制法 取10 mL西林瓶,按照處方比例依次加入1,2丙二醇、EL35、葛根素,25℃恒溫水浴,以350 r/min攪拌,使其充分溶解。加入薄荷腦、IPM。攪拌,使其充分溶解,作為A相。另取芍藥苷提取物加入相應(yīng)量的純凈水中攪拌使其充分溶解,作為B相。將B相逐滴加入A相中,不斷攪拌使混合均勻,即得。

    2.8 通竅散瘀方微乳pH值測定 取3個批號的通竅散瘀方微乳各10 g,置于西林瓶中,將pH酸度計校正平衡后,測定3個樣品的pH值。

    結(jié)果顯示,醒腦靜鼻用微乳的平均pH值為5.31,而正常生理狀態(tài)下,鼻腔內(nèi)pH值為4.5~6.5,在此PH值下,生物適應(yīng)性良好[7]。

    2.9 微乳中葛根素和芍藥苷含量測定

    2.9.1 色譜條件Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱,柱溫 30℃;流動相乙腈-甲醇-水(15∶10∶75);流速1.0 mL/min;葛根素檢測波長250 nm;芍藥苷檢測波長230 nm;進樣量10μL。

    2.9.2 標準曲線的建立 分別精密稱取葛根素、芍藥苷對照品6.64、5.2 mg,加甲醇配制成葛根素濃度為0.066 4 mg/mL,芍藥苷濃度為0.013 mg/mL的對照品儲備液。配置成一系列葛根素濃度為66.40、33.20、16.60、8.30、6.64、3.32 μg/mL 的對照品溶液。芍藥苷濃度為 26.00、13.00、6.50、3.25、2.60、1.30 μg/mL,搖勻,得到標準溶液系列。按上述色譜條件依次進樣。以測得峰面積A與其濃度C線性回歸,得葛根素標準曲線方程Y=37 784 682.811 1X+22 121.591 5,r=0.999 4,線性范圍 3.32~66.40 μg/mL,芍藥苷標準曲線方程 Y=12863791.6530X+4071.5616,r=0.9994,線性范圍 1.300~26.00μg/mL。

    2.9.3 專屬性考察

    2.9.3.1 空白體系微乳的配制 精密稱取微乳1.0644g,15000r/min 離心 10min,取上清液,于 10mL容量瓶中,加甲醇定容。取1 mL加到25 mL,加甲醇定容。取1mL加到10 mL容量瓶中,加甲醇定容。

    2.9.3.2 樣品溶液的配制 精密稱取微乳1.005 0 g,15 000 r/min離心10 min,取上清液,于10 mL容量瓶中,加甲醇定容。取1 mL加到25 mL,加甲醇定容。取1 mL加到10 mL容量瓶中,加甲醇定容。

    2.9.4 精密度實驗 取同一對照品溶液,重復進樣6次。葛根素峰面積RSD=0.13%,芍藥苷RSD=0.40%,表明本實驗的方法精密度良好。

    2.9.5 重現(xiàn)性實驗 取同一批樣品6份,分別制成供試品溶液,按含量測定法測定,結(jié)果葛根素,RSD=0.19,芍藥苷RSD=0.61,表明本實驗的方法重現(xiàn)性良好。

    2.9.6 穩(wěn)定性考察 取載藥微乳溶液,按照供試品的處理方法制成待測液后,于 0、2、4、6、8、10、12、24 h進行測定,記錄峰面積值,葛根素RSD=0.17,芍藥苷RSD=0.74,表明供試品在處理后24 h保持穩(wěn)定。

    2.9.7 載藥微乳的含量測定 取3批樣品,依供試品溶液的處理辦法制成供試品溶液,按照2.9.3項下進行測定,結(jié)果如下表2~3。

    表2 載藥微乳中葛根素的含量

    表3 載藥微乳中葛根素的含量

    2.9.8 粒徑 采用激光散射法測定了空白微乳和載藥微乳的,取稀釋10倍的載藥微乳適量,用馬爾文粒徑儀測定自微乳的粒徑和Zeta電位,記錄粒徑及電位。載藥微乳的平均粒徑(直徑)為17.86 nm,PDI為0.031,Zeta電位為-4.90 mV。空白微乳的粒徑和電位與載藥微乳差異不大,結(jié)果見圖6~7。

    圖6 載藥微乳的粒徑

    圖7 載藥微乳的電位

    3 通竅散瘀微乳對大鼠鼻黏膜和纖毛刺激性、損傷性作用及可逆性研究

    大鼠共21只,隨機分為4組,其中載藥微乳組、空白微乳組、藥物混懸液組各6只,生理鹽水組3只。第1天給藥3次,每次給藥50μL,在給藥后的第2天和第8天分別處死3只大鼠(生理鹽水組第2天處死)。取鼻中隔軟骨(帶黏膜),蘇木精-伊紅(HE)染色,石蠟切片,做光鏡觀察,結(jié)果見圖8~9。

    結(jié)果顯示,HE染色下生理鹽水組大鼠鼻粘膜病理切片中可見無上皮細胞無增生,排列整齊,杯狀細胞少,固有層無水腫。通竅散瘀微乳組病理切片可見上皮細胞的纖毛脫落,固有層水腫,腺體增生,血管不同程度擴張并略微充血。通竅散瘀微乳恢復1周組的大鼠病理切片大鼠鼻黏膜恢復正常。通竅散瘀藥液組大鼠鼻黏膜切片可見杯狀細胞增多,腺體增生,血管不同程度擴張并有充血現(xiàn)象。通竅散瘀藥液恢復1周組大鼠鼻黏膜未恢復正常,仍可見杯狀細胞增多,腺體增生,血管不同程度擴張并有充血現(xiàn)象。

    圖8 給藥第2天倒置顯微鏡下觀察圖(40×)

    圖9 給藥8天后倒置顯微鏡下觀察圖(40×)

    4 討論

    方中的葛根素是難溶性成分,提高葛根素溶解度很重要。首先采用溶解度實驗初步選出乳化劑、助乳化劑、油相,再以滴水法繪制偽三元相圖,單因素考察乳化劑、助乳化劑、油相,進一步篩選出合適的乳化劑、助乳化劑、油相。以粒徑、PDI為指標,確定乳化劑、助乳化劑、油相的比例。再以載藥量為指標,確定處方中各藥物的量,最終制備載藥微乳。

    通竅散瘀微乳能顯著提高難溶性藥物葛根素的載藥量,并且形成均一穩(wěn)定的體系。可為通竅散瘀方給藥提供新的劑型。

    通過大鼠鼻中隔切片實驗研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),以生理鹽水作為對照組,通竅散瘀微乳給藥后有一定毒性,然而在給藥1周后切片觀察,發(fā)現(xiàn)其纖毛再生,細胞在恢復,表明通竅散瘀微乳雖對大鼠鼻黏膜和纖毛產(chǎn)生刺激性,但其可以恢復。說明微乳對鼻腔的刺激性具有可逆性,可為通竅散瘀方給藥提供新的劑型。

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