水蛭素的分離純化研究進(jìn)展

于曉敏 孟天嬌 崔慶本??

摘 要： 水蛭素（Hirudin）是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然凝血酶特效抑制劑，具有活血化淤的作用。但水蛭軀體中存在無抗凝活性的偽水蛭素組分和分泌物中大量成分復(fù)雜的物質(zhì)，增加了水蛭素分離純化難度；臨床運(yùn)用對生物制品的純度要求高，世界各地很多科學(xué)家對水蛭素的提取和純化做了許多相關(guān)的研究。本文對水蛭素分離純化方法進(jìn)行了綜述，比較了多種方法的優(yōu)勢與不足，為其分離純化工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

關(guān)鍵詞： 水蛭素；分離；純化；

【中圖分類號(hào)】 R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】 2236-1879（2018）11-0256-01

水蛭是傳統(tǒng)的中藥材，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就有記載，具有破血、逐淤、通經(jīng)的功效。 水蛭中有效成分為水蛭素，是目前已知的一種高效的、特異的、最強(qiáng)的凝血酶抑制劑水蛭素具有抗凝血和溶解血栓的作用，在治療心腦血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、敗血休克、高血壓及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景。

1水蛭素的理化性質(zhì)

水蛭素干燥狀態(tài)下穩(wěn)定，室溫下水中可穩(wěn)定存在6個(gè)月，80℃下加熱15min而不被破壞。PH值升高或降低均會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性下降，在0.1mol/L鹽酸溶液或0.1mol/L氫氧化鈉溶液中可穩(wěn)定15min。水蛭素不能被胰蛋白酶水解，對α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，其原因在于水蛭素存在一個(gè)由3個(gè)二硫鍵組成的不易被降解的N-端結(jié)構(gòu)。但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶A則可使之失去活性。

2 水蛭素的分離與純化

2.1. 天然水蛭素的分離與純化。

天然水蛭素產(chǎn)生于水蛭的唾液里， 水蛭吸血時(shí)被分泌出來。楊潼等使水蛭充分饑餓，采取一種特殊的技術(shù)從活體水蛭中提取唾液腺分泌物。黃仁槐等采取擠壓的方法獲取水蛭嗦囊內(nèi)消化液。這些方式可以獲得活性很高的粗體液，但是處理較為繁瑣，效率很低。大多數(shù)研究均摘取水蛭頭部進(jìn)行勻漿處理，用丙酮、 乙醇或水提取。劉欣[1]等采用乙醇提取的方法，進(jìn)行水蛭素提取，以水蛭素體積活力為指標(biāo)，優(yōu)化乙醇提取的條件。劉洋等利用丙酮對醫(yī)用水蛭勻漿液進(jìn)行提取水蛭素粗品[2]，張彬等采用鹽浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法進(jìn)行粗提，結(jié)果表明，丙酮提取具有更高的得率[3]。丙酮沉淀法必須嚴(yán)格控制溫度，否則很容易造成水蛭素失活。覃裕永[4]使用乙醇和丙酮分次提取，真空回收溶劑后合并濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，發(fā)明工藝簡單、成本低廉，收率較高、產(chǎn)品質(zhì)量好、保存期長。目前研究水蛭素分離純化的方法很多，主要涉及到粗提純和精制兩個(gè)步驟。

2.1.1粗提

2.1.1.1 PH沉淀法：將水蛭素粗提液25 m L加入四倍體積即100mL 0.9%的Na Cl溶液稀釋，攪拌20min：用15%的三氯醋酸溶液調(diào)p H值至2.5，于66.7℃保溫30 min（適當(dāng)攪拌）后，4℃5×103r/min離心15min，收集上清液；再用l mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，4℃ 5x103r/min離心10rain，上清液即為粗提液，分別測定蛋白質(zhì)含量和水蛭素活性，同時(shí)計(jì)算蛋白質(zhì)回收率、活性回收率、純化倍數(shù)和比活。得蛋白質(zhì)回收率為45.58%，活性回收率為55.55%，純化倍數(shù)為1.22，比活為6.41 AT-U/rag，得到的水蛭素粗提液雖然比較澄清，但其純化倍數(shù)相對而言較低，原因可能是這種方法采用加入較大體積的Na Cl溶液，提供一個(gè)溫和的環(huán)境造成的溶液過稀，造成需要進(jìn)一步的處理才能得到更好的濃度；

2.1.1.2有機(jī)溶劑沉淀法：取水蛭素唾液腺分泌物10 m L，用4倍體積即40 m L含水15%的冷丙酮溶液沉淀（含水15%的冷丙酮溶液預(yù)先配制好，放冰箱中預(yù)冷保存）用玻璃棒輕輕攪拌冷丙酮溶液和水蛭素唾液腺分泌物的混合物，存放在冰箱中過夜。將混合物在5x103 r/min下離心15min，濾去上清液部分，收集沉淀，然后用15%的20 m L三氯乙酸溶液溶解，再次在5x103r/rain下離心5 rain，去除不溶解的物質(zhì)，收集上清液，分別測定蛋白質(zhì)含量和水蛭素活性，同時(shí)計(jì)算蛋白質(zhì)回收率、活性回收率、純化倍數(shù)和比活。得蛋白質(zhì)回收率為18.70%，活性回收率為33.34%，純化倍數(shù)為1.78，比活為4.71AT-U/mg，通過添加丙酮來達(dá)到沉淀的目的，但是同時(shí)給測定活性造成的了很大的困難，要求低溫操作使操作過程容易引起目標(biāo)蛋自失活；

2.1.2 精制

2.1.2.1離子交換層析法：用磷酸鹽緩沖液平衡離子交換層析柱，取10ml粗提液進(jìn)樣，用起始緩沖液充分流洗，再以0—1.0 mol/L Na Cl梯度洗脫，收集速度為10 min/管， ，自動(dòng)收集后，每隔3管（O.5 h）測定活性一次，根據(jù)所測的結(jié)果，收集活性峰，經(jīng)透析濃縮后再測定活性峰的蛋白質(zhì)含量和活性。

結(jié)果表明，利用DEAE SephadexA-50和DEAESepharoseCL-6B樹脂對水蛭素粗提液進(jìn)行離子交換層析，經(jīng)過DEAE Sephadex A一50柱層析得到的水蛭素比活性僅達(dá)到15.9AT-U/mg水蛭素，純化倍數(shù)不到3，同時(shí)回收率也不高；但是經(jīng)過DEAE Sepharosc CL-6B柱層析所得到的水蛭素比活性能達(dá)到100AT-U/mg水蛭素以上，純化倍數(shù)也接近20，活性回收率較高。可知DEAE Sepharose CL-6B柱層析的分離效果和產(chǎn)物理想程度比DEAESephadexA-50柱層析要好。

2.1.2.2凝膠過濾層析法：經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B柱層析后的水蛭素溶液3mL上樣，經(jīng)Sephadex G.25柱層析后，收集有效峰后，經(jīng)濃縮再測定其蛋白質(zhì)含量和活性。用此法進(jìn)行脫鹽，效果最好，規(guī)律性較強(qiáng)，同時(shí)隨著洗脫速度的增加，所需的洗脫時(shí)間越來越短。用30 m L/h的流速進(jìn)行脫鹽的效果最好，其收集液比活為1017AT-U/mg，蛋白質(zhì)回收率為7.22%，活性回收率為63%，純化倍數(shù)為8.73。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉欣， 張文清， 夏瑋，等. 提取水蛭有效成分初探[J]. 中成藥， 2002， 24（11）：894-895.

[2] 劉洋， 崔紅. 水蛭素的分離與純化[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2004， 25（2）：35-36.

[3] 張彬， 汪波， 龔元，等. 幾種水蛭抗凝血物質(zhì)提取及活性分析[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2012， 51（4）：92-96.

[4] 覃裕永. 一種天然水蛭素有效成分的提取方法： CN， CN 101108879 A[P]. 2008.