致瀉性大腸埃希菌檢測方式及結(jié)果分析

張雪

摘要： 目的；研究檢測腸道感染中致瀉性大腸埃希菌（DEC）的感染情況，了解本地區(qū)各種DEC的流行病學(xué)特征。方法；對835例腹瀉患者糞標(biāo)本中分離出的大腸埃希菌，用熒光PCR法檢測致病基因，鑒定DEC。結(jié)果；共檢測出148株DEC菌株（陽性率17.1%），其中，腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）14株，腸致病性大腸埃希菌（EPEC）22株，彌散聚集性大腸埃希菌（DAEC）28株和腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）65株，僅eastA陽性未能分組的19株。6～10月共檢出DEC90株。0～13歲患者檢出DEC菌株11株，陽性率10.8%（11/102）；>13～60歲患者檢出DEC菌株108株，陽性率20.3%（108/532）；>60歲患者檢出DEC菌株29株，陽性率14.4%（29/201）。結(jié)論；DEC是引起腸道腹瀉的主要致病菌之一，DEC的檢出與季節(jié)和年齡有關(guān)。分子生物學(xué)的檢測方法更靈敏，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇更加靈敏的方法，加強(qiáng)對致瀉性大腸埃希菌的檢測。

關(guān)鍵詞： 大腸埃希菌，致瀉性；致病基因；腸道感染；

大腸埃希菌是人腸道中的正常菌群，其中有些菌株攜帶致病基因，能引起腹瀉，稱為致瀉性大腸埃希菌（DEC）。根據(jù)DEC的致病特點(diǎn)和攜帶的致病基因大致分為：腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌（ETEC）、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）和彌散聚集性大腸埃希菌（DAEC）等。DEC是引起腹瀉的常見致病菌，其致病機(jī)制與致病基因或獲得性毒力質(zhì)粒有關(guān)，常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定方法不能鑒別各種致病性大腸埃希菌，檢出率較低。本研究用分子生物學(xué)方法檢測大腸埃希菌的10種致病基因，以了解本地區(qū)腸道感染中DEC的感染及流行情況。其中，eae、bfpa為EPEC 的致病基因，LT、ST為ETEC 的致病基因，ial 為EHEC 的致病基因，Aggr 為EAEC 的致病基因，draac 為DAEC 的致病基因，eastA為EAEC 的耐熱腸毒素致病基因，VT1、VT2 為兩種不同的VERO 毒素基因片段。

一、材料與方法

1.標(biāo)本來源，2015年1月至2015年12月收集本院急診及腸道門診腹瀉患者糞便標(biāo)本835例。

2.試劑與儀器，HE平板和營養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基由某公司提供，PCR引物、探針及Taq酶和dNTP等試劑均由某賽百盛生物技術(shù)有限公司合成與提供，熒光定量PCR儀為Bio-RadIQ5。大腸埃希菌ETEC診斷血清為丹麥哥本哈根產(chǎn)品。

3.細(xì)菌培養(yǎng)鑒定標(biāo)本接種于HE平板，35℃培養(yǎng)18～20h，挑取單個(gè)發(fā)酵乳糖菌落轉(zhuǎn)種營養(yǎng)瓊脂，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》要求鑒定大腸埃希菌，對部分不典型菌株用API20E確認(rèn)。

4.細(xì)菌核酸制備挑取數(shù)個(gè)分純的菌落，放入含有0.1%tritonX-100及0.5mmol/LEDTA配制溶液100μL懸浮，100℃金屬浴5min，12000×g離心5min，取上清用于PCR檢測。

5.PCR反應(yīng)用Premier公司Beacondesigner7.9軟件獲取基因編號序列，用軟件選取致瀉性大腸埃希菌各致病基因上下游引物和探針。PCR反應(yīng)體系：Mg2+濃度為5mmol/L，上下游引物濃度為0.25μmol/L，探針濃度為0.15μmol/L，dNTPs各0.2mmol/L，Taq酶為2IU，模板為3μL，用dH2O

補(bǔ)足總體積為30μL。PCR反應(yīng)條件：37℃2min，94℃3min，1循環(huán)；94℃10s，60℃40s，40循環(huán)；60℃測定熒光值。

二、結(jié)果

1.DEC檢測結(jié)果，835例腹瀉患者糞便標(biāo)本，經(jīng)培養(yǎng)共檢測出DEC148株，陽性率為17.7%（148/835）。其中，EAEC（Aggr陽性）14株，EPEC[eae陽性和（或）bfpa陽性]22株，DAEC（draac陽性）28株和ETEC[ST陽性和（或）LT陽性]65株，僅出現(xiàn)eastA陽性不能分類19株，未檢出EHEC。

2.不同季節(jié)陽性菌株種類分布，6～10月DEC菌株最多，為90株，與此段時(shí)間腹瀉高發(fā)相關(guān)。不同陽性菌株的檢出情況也呈現(xiàn)季節(jié)性，EAEC在1～3月未檢出，其余時(shí)間呈現(xiàn)散發(fā)分布；DAEC在1～3月和10～12月檢出較多，5～9月未檢出；EPEC和ETEC在9～9月檢出最多。見表1。

-：未檢出。

3.陽性菌株分離患者年齡分布，0～13歲患者檢出DEC菌株11株（EAEC2株、DAEC4株、EPEC3株、ETEC1株和僅eastA陽性1株），陽性率10.8%（11/102）；>13～60歲患者檢出DEC菌株108株（EAEC9株、DAEC21株、EPEC16株、ETEC49株和僅eastA陽性13株），陽性率20.3%（108/532）；>60歲患者檢出DEC菌株29株（EAEC3株、DAEC3株、EPEC3株、ETEC15株和僅eastA陽性5株），陽性率14.4%（29/201）。

4.方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果。分別用陽性對照菌株和陰性對照菌株進(jìn)行試驗(yàn)，陽性菌株均能得到設(shè)計(jì)預(yù)期的特異性擴(kuò)增曲線，陰性對照菌株均沒有得到特異性擴(kuò)增曲線。

三、討論

DEC是引起腹瀉的常見病原菌之一，由于形態(tài)與普通大腸埃希菌相似，傳統(tǒng)的培養(yǎng)和血清凝集法檢測陽性率偏低，且同一血清型下因攜帶不同的致病基因又可分為不同的致病類型，給臨床診斷帶來了困難。近年，國內(nèi)外已有學(xué)者依據(jù)不同菌株致病基因差異用分子生物學(xué)的方法來進(jìn)行鑒定，分子生物學(xué)可檢測致病基因，更能反映菌株的致病情況，并且，靈敏度也高于血清學(xué)檢測，因此分子生物學(xué)的方法可能會(huì)成為鑒定致DEC的常規(guī)方法。參考國外學(xué)者的分子生物學(xué)方法，通過設(shè)計(jì)各致病基因的PCR引物進(jìn)行目的基因特異性擴(kuò)增，共檢出帶有致病基因的DEC148株（陽性率17.7%），其中，EAEC（Aggr陽性）14株，EPEC[eae陽性和（或）bfpa陽性]22株，DAEC（draac陽性）28株和ETEC[ST陽性和（或）LT陽性]65株，僅出現(xiàn)eas-tA陽性不能分類19株，未檢出EHEC。研究發(fā)現(xiàn)，DEC菌株檢出率與季節(jié)有關(guān)，6～10月DEC菌株最多（90株），與此段時(shí)間腹瀉高發(fā)相關(guān)。不同陽性菌株的檢出情況也呈現(xiàn)季節(jié)性變化，EAEC在1～3月未檢出，其余時(shí)間呈現(xiàn)散發(fā)分布；DAEC在1～3月和10～12月檢出較多，5～9月未檢出；EPEC和ETEC在7～9月檢出最多。本研究發(fā)現(xiàn)，DEC菌株檢出率與與年齡也有一定相關(guān)性，0～13歲患者檢出DEC菌株11株（EAEC2株、DAEC4株、EPEC3株、ETEC1株和僅eastA陽性1株），陽性率10.8%（11/102）；>13～60歲患者檢出DEC菌株108株（EAEC9株、DAEC21株、EPEC16株、ETEC49株和僅eastA陽性13株），陽性率20.3%（108/532）；>60歲患者檢出DEC菌株29株（EAEC3株、DAEC3株、EPEC3株、ETEC15株和僅eas-tA陽性5株），陽性率14.4%（29/201）。有研究發(fā)現(xiàn)DEC菌株的檢出情況各個(gè)地區(qū)也有不同。分析本地區(qū)DEC菌株季節(jié)性特點(diǎn)和與年齡的相關(guān)性，為本地區(qū)以后的預(yù)防控制和針對性的治療提供了可靠的依據(jù)。

總之，DEC作為引起腸道感染的主要病原菌，現(xiàn)有的檢測方法已不能滿足臨床的需要，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)協(xié)作，使用準(zhǔn)確、可靠的方法檢測病原菌，為疾病的流行、控制、預(yù)防和治療提供幫助。

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