睿臻對肺癌的抑制作用及其機(jī)制

黃璐璐 杜倩倩 閆辰 劉春霞 李芋潤 高林 李燕 趙青

摘要 目的：初步探討由山楂、沙棘和枸杞三味中藥為主，并添加蟲草素、蟲草多糖、β-葡聚糖和番茄紅素等制備而成的天然藥物組方睿臻的體內(nèi)外抗肺癌活性及其機(jī)制。方法：采用MTT法檢測睿臻體外抗腫瘤活性，小鼠Lewis移植瘤模型觀察單獨(dú)使用睿臻及聯(lián)合紫素的抗肺癌活性及對荷瘤小鼠生存時間的影響。FCM實(shí)驗(yàn)檢測其對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，重組基質(zhì)膜侵襲實(shí)驗(yàn)觀察對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，Westernblot方法初步探討該化合物的作用機(jī)制。結(jié)果：睿臻對肺癌細(xì)胞具有較好的增殖抑制活性，其作用于A549細(xì)胞株、NCI-H460細(xì)胞株和NCI-H1975細(xì)胞株120h后的IC50值分別為98.42μg/mL、60.02μg/mL和60.41μg/mL；睿臻也可顯著抑制小鼠Lewis肺癌的生長，9.0g/kg睿臻對小鼠Lewis肺癌的生長抑制率達(dá)70.0%，且可在增強(qiáng)紫素的抗腫瘤活性的同時升高胸腺指數(shù)及外周血中紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白水平。睿臻可延長Lewis肺癌小鼠的生存時間。睿臻可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549和NCI-H460發(fā)生凋亡。在96.0μg/mL和192.0μg/mL劑量下，可顯著抑制肺癌細(xì)胞穿過重組基底膜的數(shù)量。Westernblot結(jié)果顯示睿臻可抑制Raf/MEK/ERK、FAK/p38等信號通路。結(jié)論：睿臻在體內(nèi)外均具有一定的抗肺癌活性，其作用機(jī)制可能與阻斷Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，有望開發(fā)成為肺癌治療的天然藥物制劑。

關(guān)鍵詞 睿臻；肺癌；增殖；凋亡；侵襲；增效減毒；Raf/MEK/ERK；FAK/p38

AbstractObjective：Toinvestigatetheanti-tumoreffectandmechanismsofRuiZhenwhichcontainshawthorn，hippophae，medlar，cordycepin，cordycepspolysaccharide，β-glucanandlycopeneon.Methods：MTTassaywasusedtoanalyzeanti-proliferationactivityofRuiZheninvitro.Anti-tumoractivityandtheeffectofsurvivaltimewereobservedbymouseLewisxenograftmodelinvivo.TheeffectofRuiZhenonapoptosiswasmeasuredbyFCManalysis.WesternblotwasperformedtoinvestigatetheexpressionlevelofproteinsintumortissuestreatedwithRuiZhen.Results：RuiZhenhasagoodproliferationinhibitoryactivityonlungcancercells.TheIC50valuesofA549cellline，NCI-H460celllineandNCI-H1975celllineafter120hwere98.42μg/mL，60.02μg/mLand60.41μg/mLrespectively.RuiZhencanalsosignificantlyinhibitthegrowthofLewislungcancerinmice，andthegrowthinhibitionrateof9.0g/kgrutheniumonLewislungcancerinmicewas70.0%，anditcanenhancethepurplepigment.Theanti-tumoractivityincreasedboththethymusindexandthenumberofredbloodcellsandhemoglobinintheperipheralblood.RuiZhencanprolongthesurvivaltimeofLewislungcancermice.RuiZhencaninduceapoptosisoflungcancercellsA549andNCI-H460.At96.0μg/mLand192.0μg/mL，thenumberoflungcancercellspassingthroughthereconstitutedbasementmembranewassignificantlyinhibited.WesternblotresultsshowedthatrutheniumcaninhibitRaf/MEK/ERK，F(xiàn)AK/p38andothersignalingpathways.Conclusion：RuiZhenhascertainanti-lungcanceractivityinvitroandinvivo，anditsmechanismmayberelatedtoblockingRaf/MEK/ERKsignaltransductionpathway.Itisexpectedtodevelopintoanaturalpharmaceuticalpreparationforlungcancertreatment.

KeyWordsRuiZhen；Lungcancer；Proliferation；Apoptosis；Invading；Efficacyenhancingandtoxicityreducing；Raf/MEK/ERK；FAK/p38

中圖分類號：R284；R734.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.049

癌癥是當(dāng)前世界對人類健康和生命威脅最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率已躍居各類疾病的前列。肺癌為我國癌癥發(fā)病率、死亡率第1位，2017中國癌癥最新數(shù)據(jù)顯示，我國平均每分鐘就有7個人患癌癥[1]。2013年我國肺癌發(fā)病人數(shù)占全球惡性腫瘤死亡人數(shù)的35.78%，死亡人數(shù)占全球的37.55%[2]?；瘜W(xué)治療仍是肺癌患者常用的治療方式，雖然目前有針對EGFR、ALK等靶點(diǎn)的化療藥物用于肺癌治療，但由于其耐藥和不良反應(yīng)的產(chǎn)生，化療藥物對肺癌的臨床治療效果不理想。在中醫(yī)藥治療腫瘤方面，中藥可以通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用，同時具有不良反應(yīng)少、機(jī)體耐受性好等優(yōu)勢。我國采用中藥聯(lián)合化學(xué)藥物治療晚期惡性腫瘤具有悠久的臨床歷史，目前該治療方式已成為臨床常用的方法[3-4]。天然藥物中存在許多具有抗癌活性的物質(zhì)。睿臻是以山楂、沙棘和枸杞三味中藥為主，并添加蟲草素、蟲草多糖、β-葡聚糖和番茄紅素等制備而成的天然藥物組方，此復(fù)方的抗腫瘤作用未見報道。本研究主要利用腫瘤細(xì)胞及小鼠移植瘤模型評價睿臻的體內(nèi)外抗腫瘤活性，并對其生物學(xué)功效及作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，人髓母細(xì)胞瘤Daoy，人肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H460和NCI-H1975，人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U-87MG購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；人腎癌細(xì)胞株Caki-1由TehBinTean（DUKE-NUSMedicalSchoolSingapore）饋贈；人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株T98G購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.1.2動物雄性C57BL/6小鼠，體重16.0～18.0g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證號：SCXK（京）2014-0004）。

1.1.3藥物睿臻為棕黃色粉末，由青海睿元藥物研究所有限責(zé)任公司提供；紫素（Taxol，北京協(xié)和藥廠，批號：151107）；順鉑（Cisplatin，DDP，上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：15663-27-1）；索拉非尼（Sorafenib，上海蓓瑯生物科技有限公司，批號：284461-73-0）；吉西他濱（Gemcitabine，武漢東康源科技有限公司，批號：95058-81-4）；吉非替尼（Iressa）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馮志強(qiáng)研究員課題組提供。

1.1.4試劑與儀器青霉素鈉鹽及硫酸鏈霉素由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司，胰蛋白酶購自北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所，胎牛血清購自北京元享圣馬生物技術(shù)研究所。牛血清白蛋白第五組分（BSA）購自美國Amresco公司。十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨、聚丙烯酰胺、焦碳酸二乙酯、瓊脂糖、甘氨酸均購自美國Sigma公司。Transwell小室購置美國Corning公司。蘇木精-伊紅（HE）染色液購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。乙二胺四乙酸鈉（EDTA）、二甲基亞砜（DMSO）、無水甲醇、異丙醇由北京化工廠生產(chǎn)。溴化四氮唑藍(lán)（MTT）、RIPA組織/細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Tween-20及溴酚蘭由北京索萊寶科技有限公司提供。甲叉雙丙烯酰胺（N，N′-Methylen-bis-Acrylamide）購自Fluka公司。ECL超敏顯色劑購自北京普利萊公司?？贵w均購于美國CellSignalingTechnology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。體外實(shí)驗(yàn)均用二甲基亞砜（DMSO）配制，并用DMSO作為溶劑對照，終濃度不超過0.1%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)睿臻用雙蒸水溶解，陽性藥（Taxol和DDP）用生理鹽水配制。MEK-6318K血球計數(shù)儀購自北京瑞博賽工貿(mào)有限公司；C6流式細(xì)胞儀購自ACCURI公司；BioTek96孔單功能發(fā)光檢測器購自美國PROMEGA公司，IX70倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司，生物分子成像儀LAS4000購自美國GE公司。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備無菌條件下，剝離傳代于小鼠腋下的Lewis肺癌腫瘤，去除筋膜，剪碎，研磨，用無菌生理鹽水按1∶3比例稀釋后制成濃度為5×107個/mL的腫瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠腋下接種0.2mL瘤液。接種后次日動物隨機(jī)分組，稱重[6]。在小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中，動物共分8組，分別為正常對照組（未荷瘤）和溶劑對照組，陽性藥Taxol給藥組，睿臻給藥組3個（2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg），聯(lián)合給藥組2個，2.25g/kg、4.5g/kg睿臻分別與15.0mg/kgTaxol聯(lián)合。

在小鼠Lewis肺癌生命延長實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動物共分5組，分別為溶劑對照組，陽性藥組，DDP（5mg/kg）+Taxol（20mg/kg），睿臻3個劑量組，2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg。

1.2.2給藥方法1）在小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中，正常對照組（未荷瘤）和溶劑對照組，每天灌胃雙蒸水，0.4mL/20g，2次/d；陽性藥Taxol給藥組，15.0mg/kg，腹腔注射，0.2mL/20g，1次/3d，共給藥3次；睿臻給藥組3個（2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg）灌胃，0.4mL/20g，2次/d；聯(lián)合給藥組2個，2.25g/kg、4.5g/kg睿臻分別與15.0mg/kgTaxol聯(lián)合；睿臻接種前給藥5d，接種后給藥9d。

在小鼠Lewis肺癌生命延長實(shí)驗(yàn)中，溶劑對照組，0.4mL/20g，2次/d，灌胃；陽性藥組，DDP（5mg/kg）+Taxol（20mg/kg），腹腔注射，0.2mL/20g，1次/周，共給藥4次；睿臻3個劑量組，2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg，灌胃，0.4mL/20g，2次/d，共給藥29d；溶劑對照組給予等體積蒸餾水。

1.2.3檢測指標(biāo)與方法

1）MTT法測定腫瘤細(xì)胞存活率：取對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后配制成濃度為1.5×104細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，按1500個/孔接種于96孔板，每孔100μL。次日加入不同濃度睿臻及相應(yīng)溶劑對照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加入100μL（DMSO終濃度<0.1%）。樣品設(shè)3～6個劑量組，每組設(shè)3個平行孔。于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)120h后，棄上清液，每孔加入新鮮配制的含0.5mg/mLMTT的無血清培養(yǎng)基100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，每孔加入200μLDMSO溶解甲臜沉淀，微型振蕩器振蕩混勻后，檢測波長570nm條件下測定吸光度值（A570）[5]，以溶劑處理的腫瘤細(xì)胞為溶劑對照組，按下列公式計算藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按照中效方程計算IC50。抑制率（%）=（A570溶劑對照組-A570給藥組）/A570溶劑對照組×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2）小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束，眼眶取血檢測血細(xì)胞個數(shù)，處死動物，稱體重，剝?nèi)⌒叵偌澳[瘤組織、稱重。根據(jù)重量計算胸腺指數(shù)，腫瘤抑制率（%），用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并進(jìn)行各給藥組與陰性對照組之間的t檢驗(yàn)。小鼠Lewis肺癌移植瘤部分腫瘤組織于-80℃冰箱保存用于后續(xù)機(jī)制研究。

在小鼠Lewis肺癌生命延長實(shí)驗(yàn)中，每周稱2次體重及腫瘤體積，每天記錄動物存活只數(shù)，根據(jù)腫瘤體積計算腫瘤抑制率（%），用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并進(jìn)行各給藥組與陰性對照組之間的t檢驗(yàn)。

3）重組基質(zhì)膜侵襲運(yùn)動實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的聚偏氟乙烯（PVPF）膜外表面涂10μLFibronectin（0.5μg/μL），置超凈臺內(nèi)風(fēng)干。在膜的內(nèi)面涂10μLMatrigel（0.5μg/μL），超凈臺內(nèi)吹干備用。在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加入10%FBS-DMEM，每孔600μL。用1mmol/LEDTA收集對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，懸浮于含0.1%BSA-DMEM培養(yǎng)基中，終濃度為2×106個/mL。將細(xì)胞懸液加到Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室中，每小室200μL。將小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2溫箱內(nèi)孵育18h。將Transwell取出，濾膜用甲醇固定10min，蘇木精-伊紅（HE）染色，水洗，用棉簽擦掉未穿過膜的細(xì)胞，用二甲苯透明后將膜封于載玻片上，于400倍顯微鏡下計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，每膜計數(shù)上中下左右5個不同視野的透過細(xì)胞數(shù)，計算平均值，每組平行設(shè)3孔。以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。抑制率（%）=（對照組侵襲細(xì)胞數(shù)-給藥組侵襲細(xì)胞數(shù)）/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

4）流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布及凋亡情況：睿臻處理肺癌細(xì)胞72h后，將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗2遍，胰蛋白酶-EDTA消化，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。4℃，800r/min離心5min收集細(xì)胞，以PBS重懸，鏡下計數(shù)后，取2×106個細(xì)胞，將其置于70%乙醇中于-20℃凍存24h以上，之后于4℃，800r/min離心5min，徹底去除乙醇。PBS洗2遍并懸浮之，加入PI染液（0.1mg/mLPI，0.02mg/mLRNaseA，1mg/mL檸檬酸鈉和0.3%TritonX-100），搖勻后于37℃避光放置0.5h，經(jīng)300目篩過濾，在ACCURIC6流式細(xì)胞儀上計數(shù)10000個細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡情況。

5）WesternBlot檢測分析蛋白表達(dá)：取小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中-80℃冰箱保存的3組（荷瘤溶劑對照組，睿臻4.5g/kg、9.0g/kg）瘤組織，每組3只研磨，組織裂解液冰上裂解1h，12000r/min離心30min，提取總蛋白，于-80℃儲存?zhèn)溆谩２捎肂CA法，以一定濃度梯度的BSA溶液為標(biāo)準(zhǔn)，于570nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時測定樣品的吸光度值，計算蛋白水平，之后用組織裂解液將各樣品調(diào)至相同濃度。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白電轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)[5]。將PVDF膜以含有5%脫脂奶粉的TTBS（0.1%Tween-20，10mmol/LTris-HCl，pH7.5，150mmol/LNaCl）室溫封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)2h。將膜與稀釋的指定的一抗4℃孵育過夜，TTBS液洗膜3次。將膜移入二抗工作液（用TTBS液按1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的二抗），室溫反應(yīng)1h。TTBS液洗膜3次，加入化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液，ECL照相系統(tǒng)照相[5-6]。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1睿臻對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用采用MTT法檢測睿臻對腫瘤細(xì)胞作用120h后的增殖抑制作用。睿臻的MTT結(jié)果顯示，睿臻對體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞株、腎癌細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的增殖均有一定的抑制作用。其中，睿臻對肺癌細(xì)胞株的生長抑制作用最為明顯，對A549細(xì)胞株、NCI-H460細(xì)胞株和NCI-H1975細(xì)胞株的IC50值分別為（98.42±1.21）μg/mL、（60.02±1.77）μg/mL和（60.41±2.56）μg/mL，在后續(xù)研究中選擇肺癌繼續(xù)進(jìn)行生物學(xué)功能的研究及機(jī)制探討。見表1。

2.2睿臻對小鼠移植瘤Lewis肺癌的生長及中位生存期的影響

采用小鼠Lewis肺癌移植瘤模型進(jìn)一步考察睿臻的體內(nèi)抗腫瘤作用。睿臻可劑量依賴性抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生長，與溶劑對照組比較，睿臻2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg3個劑量的抑制率分別為33.8%、39.9%和70.00%（P<0.001）。睿臻不僅可以抑制小鼠Lewis肺癌的生長，還可延長Lewis肺癌荷瘤小鼠的中位生存期。如表3所示，與溶劑對照組比較，陽性藥組對降低荷瘤小鼠的中位生存期，為21d；而睿臻4.5g/kg和9.0g/kg劑量組均可明顯延長荷瘤鼠的中位生存期，其分別為26d和27d，而溶劑對照組中位生存期為24.7d。在本實(shí)驗(yàn)中，溶劑對照組荷瘤小鼠在接種第10天，腫瘤體積為（1998.71±356.30）mm3；而在睿臻9.0g/kg劑量組中，腫瘤體積為（749.35±355.05）mm3，抑制率達(dá)到62.51%（P<0.001），提示睿臻在抑制小鼠肺癌生長的同時可延長荷瘤小鼠的生存時間。見表2，圖1。

在小鼠Lewis肺癌移植瘤模型中，睿臻不僅對腫瘤生長具有較強(qiáng)的抑制作用，還可增強(qiáng)Taxol的抗腫瘤活性。與溶劑對照組比較，15.0mg/kgTaxol對小鼠Lewis肺癌生長的抑制率為43.4%（P<0.001）；灌胃給予2.5g/kg、4.5g/kg睿臻對小鼠Lewis肺癌的生長抑制率分別為33.8%和39.9%（P<0.001），而當(dāng)與15.0mg/kgTaxol聯(lián)合應(yīng)用時抑制率可分別達(dá)到55.8%（P>0.05，與單獨(dú)使用Taxol組比較）和58.0%（P<0.05，與單獨(dú)使用Taxol組比較），提示睿臻與Taxol具有協(xié)同效應(yīng)。見表2，圖1。

胸腺是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場所，其功能與免疫緊密相關(guān)，胸腺指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。本研究通過比較各組動物間的胸腺指數(shù)以考察睿臻對荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。與正常小鼠比較，荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)明顯降低（P<0.05）；與溶劑對照組比較，睿臻在4.5g/kg和9.0g/kg劑量下，可升高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)。陽性藥Taxol給藥組可引起荷瘤小鼠胸腺指數(shù)的進(jìn)一步降低（P<0.05，與溶劑對照組比較）。當(dāng)4.5g/kg睿臻與Taxol聯(lián)合使用時，與陽性藥Taxol給藥組比較，荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)明顯升高（P<0.05）。因此推測睿臻可以改善Taxol對荷瘤小鼠所造成的免疫功能抑制。見圖2。

為了初步觀察睿臻在治療中的不良反應(yīng)，本研究觀察了單獨(dú)使用睿臻及與Taxol聯(lián)合使用時對Lewis肺癌小鼠外周血計數(shù)的影響。與正常小鼠比較，荷瘤小鼠外周血中的白細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P<0.001），而紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白水平顯著降低（P<0.001）；陽性藥Taxol可降低荷瘤小鼠外周血中的血紅蛋白水平，對紅細(xì)胞數(shù)量無明顯影響（P>0.05）。與溶劑對照組比較，睿臻各劑量組均可升高外周血中的紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白水平；此結(jié)果提示，睿臻對荷瘤小鼠外周血無明顯的不良反應(yīng)，且可升高化療后的紅細(xì)胞及血紅蛋白數(shù)量。見表4。

2.3睿臻對肺癌細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證睿臻對肺癌細(xì)胞的作用，本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測睿臻對肺癌細(xì)胞凋亡的影響。睿臻處理A549和NCI-H460細(xì)胞72h后，凋亡細(xì)胞數(shù)劑量依賴性增加。在A549細(xì)胞中，在48.0μg/mL和96.0μg/mL劑量下，凋亡細(xì)胞所占比例分別為（20.37±4.40）%和（31.17±2.25）%，而溶劑對照組凋亡細(xì)胞比例為（12.93±2.00）%。在NCI-H460細(xì)胞中，當(dāng)睿臻劑量為60.0μg/mL，120.0μg/mL時，可分別引起（14.00±2.69）%和（31.27±8.83）%的細(xì)胞凋亡，對照組凋亡率僅為（7.23±2.31）%。上述結(jié)果表明，睿臻可有效地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖3。

2.4睿臻對A549和NCI-H460細(xì)胞侵襲能力的影響

采用重組基質(zhì)膜侵襲實(shí)驗(yàn)觀察對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，在96.0μg/mL和192.0μg/mL劑量下，睿臻可顯著減少A549細(xì)胞和NCI-H460細(xì)胞穿過重組基底膜的數(shù)量。在A549細(xì)胞中，對腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制率分別為（66.0±1.54）%和（80.2±3.59）%；在NCI-H460細(xì)胞中，抑制率分別為（70.54±1.68）%和（83.5±6.08）%。在250.0μg/mL劑量下，睿臻作用18h對A549和NCI-H460細(xì)胞的生長抑制率僅為（13.00±2.22）%和（11.89±14.60）%，而侵襲實(shí)驗(yàn)中選用最大濃度為192.0μg/mL，說明睿臻抑制A549和NCI-H460細(xì)胞侵襲的活性可能不是由抑制細(xì)胞生長造成的。見圖4。

2.5睿臻對小鼠Lewis肺癌組織內(nèi)蛋白表達(dá)水平的影響

細(xì)胞增殖的失控和細(xì)胞凋亡的抑制是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要基礎(chǔ)。這兩者共同引起體內(nèi)細(xì)胞動態(tài)平衡的破壞[7]。上述研究結(jié)果表明，睿臻可明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，為探討其作用機(jī)制，采用WesternBlot方法檢測藥物對相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。文獻(xiàn)報道，c-Raf介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖和存活，且在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[8-11]，因此我們首先檢測了睿臻對c-Raf相關(guān)蛋白活性的影響。睿臻可顯著抑制Lewis肺癌組織內(nèi)p-c-Raf（Ser289）、p-MEK和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)，在4.5g/kg劑量下對MEK和ERK的總水平并無顯著影響，但在9.0g/kg劑量下略降低兩者的表達(dá)。進(jìn)一步檢測睿臻對肺癌組織內(nèi)p53、c-caspase3和c-PARP等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[12-15]。本研究結(jié)果顯示，睿臻可顯著上調(diào)p53、c-caspase3和c-PARP的水平。提示睿臻可能通過阻滯Raf/MEK/ERK信號通路，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖。見圖5。

FAK/p38信號通路與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[16-17]，為此進(jìn)一步檢測了睿臻作用后肺癌組織內(nèi)FAK/p38信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，睿臻能顯著降低p-FAK（Tyr397）、p-p38MAPK和MMP2的表達(dá)，但在9.0g/kg劑量下，對FAK的總水平有明顯的抑制作用，而對p38MAPK的總水平無顯著影響。因此，我們初步推測睿臻抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力可能與其對FAK/p38信號通路的抑制作用有關(guān)。

3討論

肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高，易轉(zhuǎn)移3大特點(diǎn)，且臨床治療難度大[18]。目前，化學(xué)治療仍然是治療晚期肺癌常用的治療手段，但由于化療易引起機(jī)體耐藥及較嚴(yán)重的不良反應(yīng)[3-4，19-21]，因此尋找安全有效治療肺癌的方法和藥物是各國科學(xué)家研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。中藥具有多靶標(biāo)的特點(diǎn)，在治療上通常會產(chǎn)生藥效疊加，毒性分散的效果[3，16，19]，所以預(yù)期中藥復(fù)方會對癌癥起到較好的治療及輔助治療的作用。山楂中含有山楂酸、果皮多酚及果肉多酚等多種抗癌物質(zhì)[22-23]。沙棘不但在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用，同時還在抗癌抑瘤方面療效顯著[24]。枸杞多糖是枸杞中的主要成分，能夠抑制多種腫瘤的生長，提高機(jī)體免疫力[25-26]。蟲草素對肺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞生長增殖均具有抑制作用[27]。因此研究以上述成分為主的天然藥物組方——睿臻的抗肺癌作用及其機(jī)制研究具有重要的意義，且該組方的抗肺癌作用國內(nèi)外未見報道。

本研究中發(fā)現(xiàn)睿臻對A549、NCI-H460和NCI-H1975肺癌細(xì)胞株具有較好的體外抑制活性，進(jìn)一步體內(nèi)研究結(jié)果表明其可抑制小鼠Lewis肺癌的生長，延長荷瘤鼠的中位生存期。目前，Taxol為主要的肺癌化療藥物，睿臻可增加Taxol的抗腫瘤活性，同時可升高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)，升高Taxol降低的胸腺指數(shù)，推測睿臻可通過調(diào)節(jié)荷瘤鼠的免疫功能進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤作用，且睿臻可能對Taxol造成的免疫抑制有一定的緩解作用。睿臻對荷瘤小鼠的外周血無明顯不良影響，與化療藥物Taxol聯(lián)合使用可以增加荷瘤鼠外周血中紅細(xì)胞和血紅蛋白的數(shù)量，提示睿臻有可能對化療藥物造成的造血功能損傷起到一定的緩解作用，因此睿臻與化療藥Taxol聯(lián)用具有增效減毒的作用，為臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

睿臻可降低Lewis肺癌組織內(nèi)c-Raf的磷酸化水平，導(dǎo)致MEK磷酸化及下游信號通路的顯著抑制，表現(xiàn)為ERK磷酸化水平的明顯下降，進(jìn)而促進(jìn)p53、c-caspase3和c-PARP的表達(dá)。Raf/MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡；在Raf/MEK/ERK信號通路的作用下，細(xì)胞內(nèi)c-caspase-3、c-PARP表達(dá)水平降低，腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制。因此，睿臻可能是通過抑制肺癌組織內(nèi)c-Raf的磷酸化水平，進(jìn)而抑制Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而上調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。睿臻可降低肺癌組織內(nèi)p-FAK（Tyr397）的水平，進(jìn)而抑制p38MAPK磷酸化及下游信號通路蛋白MMP2等的表達(dá)。轉(zhuǎn)移是肺癌致死的主要原因，這是臨床上治療肺癌的難點(diǎn)，也是肺癌研究的熱點(diǎn)[21，28]。已有研究表明FAK/p38信號通路參與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程[16-17]，因此推測睿臻抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的作用有可能與抑制FAK/p38MAPK信號通路相關(guān)。

本研究結(jié)果初步證明，睿臻可通過阻滯Raf/MEK/ERK和FAK/p38信號通路，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用。在顯著抑制腫瘤生長的同時，睿臻對荷瘤小鼠的免疫功能及造血功能亦有一定的保護(hù)作用。睿臻在抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)面表現(xiàn)出較好的效果和廣闊的應(yīng)用前景，其抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究，期望經(jīng)過我們的努力，睿臻能夠開發(fā)成為抗腫瘤的復(fù)方制劑，造福廣大腫瘤患者。

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（2018-03-28收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）