張 倩 賀明榮 陳為峰 代興龍 王振林 董元杰? 諸葛玉平?
(1 山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院,土肥資源高效利用國家工程實驗室,山東泰安 271018)
(2山東農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,山東泰安 271018)
土壤鹽漬化是影響植物生長、導致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要因素之一[1]。鹽脅迫會引起植物形態(tài)、生理、生物化學等多方面變化[2]。高濃度NaCl會使植物根部土壤水勢降低,根系吸取水分困難從而產(chǎn)生滲透脅迫。同時鹽脅迫條件下葉片氣孔關(guān)閉,植物體內(nèi)電子運輸與光合器官受損,導致光合作用及生產(chǎn)率下降。鹽脅迫同樣會使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧,造成脂類、蛋白質(zhì)和氨基酸的氧化損傷,引起代謝紊亂,最終導致作物產(chǎn)量下降[3]。
一氧化氮(Nitric oxide, NO)和水楊酸(Salicylic acid, SA)是植物體內(nèi)普遍存在的兩種小分子信號物質(zhì),且均在植物抵抗生物和非生物逆境脅迫反應中起重要作用[4]。SA與NO的信號應答途徑并非孤立的,二者在很多抗逆反應中均存在交互作用[5]。研究表明,SA能夠誘導擬南芥中NO的合成,且在一定范圍和時間內(nèi)NO合成量隨SA濃度升高而增加[6]。而在煙草的系統(tǒng)獲得抗性信號通路中,NO活性完全依賴于SA功能作用[7]。Singh等[8]研究認為,NO與SA能夠協(xié)同調(diào)節(jié)植物體內(nèi)亞砷酸鹽脅迫反應信號。在對NO和SA減輕紅花的鋅毒害作用的研究中發(fā)現(xiàn),復合施用較單獨施用緩解毒害效果更加顯著[9]。此外,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)外源施加SA與NO均能緩解鎳對龍爪稷幼苗[10]及甘藍型油菜[11]的毒害作用,但其復配處理效果更具優(yōu)勢。
小麥作為三大糧食作物之一,具有較高的營養(yǎng)價值。有研究顯示SA和NO能夠提高小麥中波紫外線脅迫抗性,且二者結(jié)合施用時效果最佳[12]。而有關(guān)外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗生長影響的相關(guān)研究尚少見報道。因此本試驗以小麥為研究對象,以硝普鈉(Sodium nitroprusside,SNP)為NO供體,研究鹽脅迫下外源NO和SA單獨及復合施用對其幼苗生長、光合色素合成及抗氧化酶系統(tǒng)的影響,以期了解外源NO、SA及其復合施用對鹽脅迫下小麥幼苗生長的緩解效應,并揭示其緩解機理,為鹽堿土壤上的小麥高產(chǎn)栽培和鹽漬化土地的開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。
試驗于2017年9月在山東農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院植物營養(yǎng)學實驗室進行。供試小麥(Triticum aestivum L.)品種“山農(nóng)22號”,該品種為山東省栽培面積較廣的一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的小麥品種但耐鹽性較差。選取籽粒飽滿、大小均勻、無病蟲害的種子,經(jīng)0.1%的NaClO消毒10 min,然后用蒸餾水反復漂洗干凈,置于SPX-2501C型人工智能氣候箱中25℃下恒溫培養(yǎng)。待種子露白后,播于洗凈的濕潤蛭石中,萌發(fā)后用1/2 Hoagland營養(yǎng)液澆灌。待小麥長出兩片葉后挑選長勢一致的植株洗凈根部蛭石后,移栽至盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的玻璃器皿中,每盆25株,營養(yǎng)液調(diào)pH至6.5~6.8,幼苗生長條件的室內(nèi)晝/夜溫度為25/18 ℃,光強為100μmol·m-2·s-1,光照時間14 h·d-1。
試驗設(shè)6個處理:1) CK: Hoagland營養(yǎng)液處理;2) NaCl: Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl;3) SA: Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA;4) SNP: Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SNP;5) 1/2(SA+SNP): Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+50 μmol·L-1SA +50 μmol·L-1SNP;6) SA+SNP : Hoagland營養(yǎng)液+120 mmol·L-1NaCl+100 μmol·L-1SA+100 μmol·L-1SNP,每個處理重復3次,每盆每次用250 mL 配制的混合液進行處理。每隔2 d換一次混合液,處理14 d后進行各項指標的測定。
鮮重和干重的測定:采取各部分植株樣,用去離子水將其沖洗干凈,再用吸水紙吸干,直接測定各部分鮮重(FW)。將新鮮材料放于105℃烘箱中殺青30 min后,在 70 ℃下烘干至恒重,然后測定植株干重(DW)。
光合色素含量的測定:用96%的乙醇將采取的幼葉研磨成勻漿,并在25 mL容量瓶內(nèi)定容,搖勻后用分光光度計分別測定在665、649和470 nm下的吸光度值,然后利用相關(guān)公式計算出葉綠素和類胡蘿卜素的含量。
電解質(zhì)滲出率的測定:相對電導值(%)=第一次電導值/殺死后電導值×100%;
電解質(zhì)滲出率(%)=(樣品相對電導值-對照相對電導值)/(100%-對照相對電導值)×100%。
N、P、K、Na、Ca、Mg含量測定:植株樣品經(jīng)烘干、研磨過篩后,H2SO4-H2O2消化,凱氏定氮法測定全氮含量、鉬銻抗比色法測定全磷含量,火焰光度計法測定全鉀、全鈉含量。植株Ca、Mg含量采用HNO3-HClO消煮,并用原子吸收分光光度計進行測定[13]。
H2O2含量測定:參照Patterson等[14]的方法,采用三氯乙酸(Trichloroacetic acid, TCA)進行冰浴研磨,低溫離心后加入磷酸緩沖液和KI溶液于390 nm下進行比色測定。
抗氧化酶活性的測定[15]:取樣品加入磷酸緩沖液冰浴研磨,低溫離心后超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性測定采用氮藍四唑(Nitro-blue tetrazolium, NBT)法,過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法,過氧化氫酶(Catalase , CAT)活性測定采用紫外吸收法。
采用Excel 2003軟件處理數(shù)據(jù)和繪表,采用DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析,采用最小顯著極差法(LSD)進行差異顯著性檢驗(P < 0.05)。
行動主張:建議學院優(yōu)先從教學管理組織結(jié)構(gòu)進行控制,強調(diào)及加強教研室的管理功能,加強教師團隊建設(shè)及對教師個人能力提升的支持與鼓勵,當然也應建立相應淘汰機制。教學單位應合理安排好課程結(jié)構(gòu),結(jié)合學院硬件實施(以及及時申購或添置必要實訓設(shè)施)、學生層次,設(shè)置好課程任務,在課程實施過程中,以師帶徒,提高學生能力及加強學院學風建設(shè)。
由表1可知NaCl處理顯著抑制小麥幼苗的生長。與CK相比,NaCl處理下小麥幼苗的地上部鮮重和干重分別降低45.65%和6.46%,地下部鮮重和干重分別降低55.80%和12.44%,且差異顯著。添加外源NO或SA之后都能夠緩解鹽脅迫,二者的復合處理也可以提高小麥幼苗的地上部和地下部鮮重及干重。其中1/2(SA+SNP)處理地上部鮮重及干重較NaCl處理分別增加67.34%和6.80%,地下部鮮重及干重分別增加76.91%和17.61%,且差異顯著,可見其效果最明顯。
表1 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗干鮮重及根系活力的影響Table 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on fresh or dry matter weight and root activity of the wheat seedlings under salt stress
根系活力是根生命力強弱的綜合評價指標,反映植物根系的整體發(fā)育狀況。由表1可知,與CK相比,NaCl處理可顯著降低小麥幼苗的根系活力。SNP 和SA單獨處理小麥幼苗根系活力分別較NaCl處理提高52.34%、47.56%; SNP和SA復合處理下其根系活力分別較NaCl處理提高74.26%、61.94%,且差異顯著。說明外源NO、SA及其復合處理在鹽脅迫下均可促進小麥幼苗根系的生長,提高其根系活力,從而促進植株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及地上部的良好生長,且以1/2(SA+SNP)交互作用效果更明顯。
由表2可見,鹽脅迫顯著降低小麥幼苗葉片光合色素的含量。與CK相比,NaCl處理的葉綠素a (Chlorophyll a, Chl a)、葉綠素b(Chlorophyll b, Chl b)和類胡蘿卜素(Carotenoid, Car)的含量分別降低16.98%、17.86%、5.03%。隨著SNP或SA的添加,Chl a、Chl b和Car 的含量均有明顯的提高。其中1/2(SA+SNP)處理提高的幅度更大,且與NaCl處理差異顯著,其Chl a、Chl b和Car的含量較NaCl處理分別提高39.58%、24.46%、33.06%。表明NaCl處理對小麥幼苗產(chǎn)生脅迫,而外源N O與S A可以緩解這種脅迫,尤其是1/2(SA+SNP)的復合處理對鹽脅迫的緩解效果更明顯。
圖1 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗超氧陰離子產(chǎn)生速率(A)及過氧化氫含量(B)的影響Fig. 1 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on generation rate (A) and H2O2 content (B) of the wheat seedlings under salt stress
表2 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗葉片光合色素含量的影響Table 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on chlorophyll contents in leaves of the wheat seedlings under salt stress/(mg·g-1 FW)
22變化趨勢類似,NaCl處理下顯著提高,添加SNP和SA均可降低鹽脅迫下H2O2且差異顯著,其中1/2(SA+SNP)處理H2O2的累積量降低最為明顯。
鹽脅迫誘導丙二醛(MDA)的積累,促進膜脂過氧化對小麥幼苗的傷害(圖2A)。與CK相比,NaCl處理下小麥幼苗葉片和根系中的MDA含量分別提高38.95%、56.29%。添加SNP或SA均可以起到緩解效應,其中SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比,1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的MDA含量顯著降低,分別降低15.78%、24.23%,表現(xiàn)出更好的緩解效果。
鹽脅迫處理下小麥幼苗的電解液滲出率均顯著升高(圖2B)。與CK相比,NaCl處理的電解液滲出率提高70.72%。而添加SNP或SA均可以顯著降低電解質(zhì)滲出率,并且SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯,與其他3個處理相比也具有顯著差異。與NaCl處理相比,1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗的電解質(zhì)滲出率降低32.50%,表現(xiàn)出更好的緩解效果。
超氧化物歧化酶(SOD)的活性在NaCl處理下顯著降低(圖3A)。與CK相比,NaCl處理使小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性分別降低18.67%、41.79%。添加SNP或SA可以緩解鹽脅迫造成的SOD活性降低,其中SNP和SA交互作用的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比,1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性顯著提高,分別提高14.49%、21.53%,表現(xiàn)出最好的緩解效果。為適應鹽脅迫,NaCl處理下小麥幼苗的過氧化物酶(POD)活性顯著提高(圖3B)。與CK相比,其葉片和根系中的POD活性分別提高10.86%、12.11%。隨著SNP和SA的添加,各處理均顯著提高小麥幼苗的POD活性,起到緩解鹽害的作用,其中SNP和SA復合處理的緩解效應更明顯。與NaCl處理相比,1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的SOD活性分別提高9.12%、7.34%,具有顯著差異,表現(xiàn)出最好的緩解效果。
圖2 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗丙二醛含量(A)及電解質(zhì)滲出率(B)的影響Fig. 2 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on MDA content (A) and electrolyte leakage (B) of the wheat seedlings under salt stress
圖3 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗SOD(A)、POD(B)及CAT(C)酶活性的影響Fig. 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on SOD (A), POD (B) and CAT (C) activity of the wheat seedlings under salt stress
脯氨酸在植物體內(nèi)的含量在一定程度上反映植物的抗逆性。由圖4可知,在鹽脅迫條件下,脯氨酸含量增加,從而小麥幼苗更好地適應鹽脅迫逆境。隨著SNP和SA的添加,進一步提高了小麥幼苗的脯氨酸含量,起到緩解鹽害的作用,其中SNP和SA交互作用的緩解效應更為明顯。與NaCl處理相比,1/2(SA+SNP)處理小麥幼苗葉片和根系中的脯氨酸含量分別增加了6.62%、35.55%,差異顯著,表現(xiàn)出更好的緩解效應。
圖4 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗脯氨酸含量的影響Fig. 4 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on proline content of the wheat seedlings under salt stress
由表3可知,在NaCl處理下,小麥有幼苗葉片和根系中的Na含量顯著增加,分別較CK增加2.67倍和3.57倍。添加外源SNP與SA之后,Na含量有所下降,尤其是1/2(SA+SNP)處理Na含量顯著下降。可見1/2(SA+SNP)處理抑制了小麥對Na的吸收。
N、P、K、Ca、Mg的含量在NaCl處理條件下降低,說明過量的Na抑制這些礦質(zhì)元素的吸收。然而添加外源SNP或SA或SNP+SA可以緩解N、P、K、Ca和Mg含量的降低,并促進小麥幼苗對這些礦質(zhì)元素的吸收。其中,1/2(SA+SNP)處理結(jié)果差異顯著。與NaCl相比,1/2(SA+SNP)處理條件下,N在葉和根中的含量分別增加15.49%、27.30%;P在葉和根中的含量分別增加23.04%、21.40%;K在葉和根中的含量分別降低3.08%、97.78%;Ca在葉和根中的含量分別降低45.07%、110.12%;Mg在葉和根中的含量分別降低15.85%、18.87%,且均具有顯著差異。
表3 外源NO與SA復合調(diào)控對鹽脅迫下小麥幼苗礦質(zhì)元素含量的影響Table 3 Effects of extraneous nitric oxide and salicylic acid on mineral elements content of the wheat seedlings under salt stress /(mg·kg-1)
Tariq等[16]研究表明鹽脅迫會抑制植物的光合作用、養(yǎng)分平衡、抗氧化酶活性、可溶性物質(zhì)積累等多種生理過程,進而抑制植株生長。而NO和SA作為生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以參與逆境脅迫的多重生理調(diào)控。本試驗結(jié)果顯示NaCl處理降低小麥幼苗的干重及鮮重,而添加外源物質(zhì)可以緩解這種影響,并且SNP與SA復合處理條件下小麥的鮮重和干重較單獨施用效果更好,尤其是1/2(SA+SNP) 效果更優(yōu)。通過測定小麥的根系活力、葉片的葉綠素含量,可以看出SA+SNP顯著提高了鹽脅迫下小麥的根系活力和葉綠素含量。SA+SNP可以通過提高根系活力來促進小麥對礦質(zhì)元素的吸收,也可以通過促進葉綠素的合成來提高小麥的光合作用,進而對鹽害有很大的緩解作用。有研究表明,外源添加NO和SA能夠有效修復亞砷酸鹽對水稻根系生長及葉綠素合成的抑制作用[8],這與本研究結(jié)果一致。此外,SNP和SA對鹽害的緩解作用還可能是因為對膜功能和抗氧化劑的保護作用。
在本研究中,N a C l處理增加了小麥幼苗的膜脂過氧化作用,而外源NO和SA,尤其是1/2(SA+SNP),顯著降低了MDA積累。Gunes等[17]研究表明SA可以通過抑制OH-的合成來降低MDA的含量;此外NO可以通過降低和H2O2的積累來降低膜脂過氧化作用[18]。鹽脅迫對植物的另一直接毒性作用表現(xiàn)為過量的Na造成了細胞膜電解質(zhì)滲出率增加。鹽脅迫下MDA含量和電解質(zhì)滲出率的增加會導致小麥的生理生化功能衰退,最終阻礙植株生長。試驗表明外源添加SNP和SA可以降低小麥幼苗的電解質(zhì)滲漏率和MDA含量,其中以1/2(SA+SNP)效果更優(yōu)。Bastam等[19]研究表明SA可通過促進對離子的吸收和提高抗氧化能力來維護膜功能,從而保護植物免受氧化損傷。外源添加SA和SNP降低電解質(zhì)滲漏率可能是由于減緩了生物膜的過氧化作用,從而減輕了鹽脅迫下小麥質(zhì)膜受損程度。
本研究測定了鹽脅迫對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響。在NaCl處理下,外源添加SNP和SA,可以提高小麥幼苗葉片和根系中脯氨酸的含量, 以1/2(SA+SNP)處理效果更好。這可能是由于NO與SA通過促進脯氨酸生物合成的基因表達來影響脯氨酸濃度。有研究表明脯氨酸可以通過和生物大分子(比如DNA、蛋白質(zhì))相互作用清除羥自由基,從而穩(wěn)定生物大分子的結(jié)構(gòu)。Tan等[18]表明NO與SA可以通過誘導脫落酸合成來調(diào)節(jié)脯氨酸的含量,從而緩解滲透脅迫。因此可以推斷,鹽脅迫下NO與SA對滲透物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能是其保護小麥幼苗免遭鹽害的原因之一。
有研究表明植物對鹽脅迫的主要反應是減少K的含量,Na替代K的吸收從而導致營養(yǎng)失衡[23]。在本研究中,NaCl處理增加了小麥幼苗葉片和根系中Na的含量,降低了其它礦質(zhì)元素(N、P、K、Ca、Mg)的含量。這可能是由于離子間存在競爭排斥作用,高濃度的Na+和Cl-競爭排斥了其他離子的吸收,從而導致小麥礦質(zhì)養(yǎng)分含量降低。而研究結(jié)果表明SNP和SA的復合施用可以促進N、P、K、Ca、Mg元素的吸收,從而提高這些礦質(zhì)元素在地上部的積累。同樣,SA+SNP可以通過提高對其他元素的吸收來降低對Na的吸收??梢奡A+SNP可以改善鹽脅迫誘導的礦質(zhì)營養(yǎng)失衡,從而促進小麥幼苗的生長。
與單獨添加SNP或SA相比,SA+SNP復合處理更能顯著提高鹽脅迫下小麥幼苗葉綠素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸和可溶性蛋白含量;降低產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量以及電解質(zhì)滲漏率;提高小麥根系活力,促進其對N、P、K、Ca等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收,同時抑制了Na的吸收,減少小麥體內(nèi)的Na含量,從而緩解了鹽脅迫對小麥生長的抑制作用。本研究條件下,各處理中以1/2(SA+SNP)處理的緩解小麥鹽脅迫的效果最優(yōu)。